[发明专利]芳樟醇合成酶突变体、重组表达载体及芳樟醇生产工程菌

说明书

本发明公开了一种芳樟醇合成酶突变体，所述芳樟醇合成酶突变体包含如下氨基酸突变中的一种或两种组合：E352H或E343D。本发明还公开了编码所述的芳樟醇合成酶突变体的突变型基因或核酸。本发明还公开了含有所述的芳樟醇合成酶突变体、所述的突变型基因或核酸的重组载体、重组细胞或重组菌及其应用。本发明根据酿酒酵母密码子偏好性合成了薄荷来源的芳樟醇合成酶基因，并建立以竞争性合成途径中番茄红素的颜色指示高通量筛选方法，首次对芳樟醇合成酶进行了定向进化改造，获得了催化活力提高的芳樟醇合成酶突变体，并将筛选到的芳樟醇合成酶突变体应用到酿酒酵母芳樟醇的生产中，为其它单萜的微生物合成提供了方法借鉴。

技术领域

本发明属于酶工程与代谢工程领域，具体涉及一种通过定向进化手段获得催化能力提高的芳樟醇合成酶突变体、编码它的核酸序列、含有该突变体基因的重组表达载体，以及在酿酒酵母中的表达及其应用。

背景技术

芳樟醇是天然存在于植物中的具有特殊香味的非环状单萜烯醇，不仅具有抗菌、驱避杀虫、消炎止痛以及镇静等多种生物学功效，还可以作为维生素A、维生素E以及异植物醇生产过程中的重要中间体，是食品、医药、化妆品行业的重要原料。目前，市场上的芳樟醇主要来源于植物提取和化学合成两种方法。由于植物生长周期长，且提取工艺复杂，提取的产品纯度低，并不能满足人们对其日益增长的需求。而化学合成的芳樟醇工艺复杂，成本高。随着芳樟醇合成酶的发现，代谢改造微生物生产芳樟醇具有巨大的潜力。国际竹藤中心将来自土肉桂的芳樟醇合成酶定位到酿酒酵母线粒体中，在酿酒酵母的线粒体中完整构建了甲羟戊酸等途径(MVA)利用了在线粒体和细胞质共同参与合成芳樟醇(CN 109554403A)。但是芳樟醇合成酶作为芳樟醇合成途径中的关键酶，其在微生物内的表达量和催化活性都比较低，成为限制芳樟醇异源微生物合成的主要瓶颈问题。为了进一步提高芳樟醇异源微生物合成的产量，本发明通过定向进化手段对芳樟醇合成酶进行突变，使其具有更高的活性，并在酿酒酵母中进行表达。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种通过定向进化手段获得的芳樟醇合成酶突变体基因和其编码的蛋白，以及其在微生物异源合成芳樟醇中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种芳樟醇合成酶突变体，所述芳樟醇合成酶突变体包含如下氨基酸突变中的一种或两种组合：E352H或E343D。

突变体E352H代表第352位由谷氨酸突变成组氨酸，突变体E343D代表第343位谷氨酸突变成天冬氨酸。

其中，所述芳樟醇合成酶突变体为E352H和E343D的双突变体，双突变体代表第352位由谷氨酸突变成组氨酸，同时第343位谷氨酸突变成天冬氨酸。

本发明内容还包括编码所述的芳樟醇合成酶的突变型基因或核酸。

其中，编码所述芳樟醇合成酶的突变型基因或核酸的第1054位核苷酸由G突变为C、第1056位核苷酸由A突变为C；和/或第1029位核苷酸由A突变为C。

其中，所述芳樟醇合成酶的突变型基因序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

其中，序列表中的SEQ ID NO.4的氨基酸序列编码的芳樟醇合成酶命名为t67OMcLIS^E343D/E352H，所述突变体相对于野生型的氨基酸其第343位谷氨酸突变成天冬氨酸、第352位谷氨酸突变成组氨酸。

其中，任何对所述SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸、N端氨基端截短、羧基端截短并在氨基酸水平具有至少70％同源性的序列，且具有芳樟醇合成酶活性的，即能催化牻牛儿基焦磷酸(GPP)转化成芳樟醇的，仍属于本发明的保护范围。

本发明内容还包括含有所述的芳樟醇合成酶突变体、所述的突变型基因或核酸的重组载体、重组细胞或重组菌。