[发明专利]基于虚拟分割方法的生物靶标数字化定量芯片检测方法

说明书

本发明提供基于虚拟分割方法的生物靶标数字化定量芯片检测方法，所述方法包括用磁珠对待测生物靶标进行处理、富集和捕获，所述待测生物靶标的液体和中介配体反应液分别在压力驱动下进入微流控芯片内，将连接所述中介配体的磁珠随机平铺并固定到所述微流控芯片反应区平面上，在所述微流控芯片反应区平面上进行所述液相‑固相原位发光反应，获得反应后所述微流控芯片反应区平面上的数字图片，然后采用虚拟分割方法，实现所述待测生物靶标的数字化定量检测。本发明整个方法所要求的检测系统大大简化，检测耗材和检测系统成本大大降低，大大拓宽了数字定量技术应用。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及基于虚拟分割方法的生物靶标数字化定量芯片检测方法。

背景技术

体外诊断技术(In Vitro Diagnosis，IVD)是在人体之外，通过对人体的样品(血液、体液、组织等)进行样品处理、生化反应以及结果检测，从而获得临床诊断信息的技术。体外诊断技术的检测对象是液体，常规检测体积1～100ml。液体中的生物、化学物质主要是核酸分子(DNA/RNA)，蛋白分子。体外诊断检测的主要人体样品是血液。由于正常人体生物、化学物质在血液中的浓度相对恒定，特定生物、化学物质的浓度变化，可以表征人体是否处于健康状态。体外诊断过程可以分为以下三个阶段。

(一)样品处理

人体样品，尤其是血液，含有多种生物、化学物质，例如DNA/蛋白靶分子。需要对样品进行处理，对待检测的靶分子进行富集、纯化，从而减少人体样品中其余物质对生化反应和结果检测的干扰。

(二)生化反应

体外诊断中，经过处理和捕获的靶分子一般浓度较低。需要经过配体放大反应，增大靶分子物质量或者表征靶分子的物质量。例如，常用的DNA靶分子配体放大反应是PCR反应，通过反应增大待测DNA分子的物质总量；常用的蛋白靶分子配体放大反应是ELISA(酶联促发反应)，通过反应生成大量化学发光分子用于表征蛋白靶分子，增大蛋白靶分子的检测信号。

(三)结果检测

常规生物、化学检测技术基于光学检测。经过配体放大反应后，较高浓度的核酸、蛋白光学标记物(例如荧光基团、化学发光物质)通过光学器件检测，例如光电倍增管(PMT)或者CCD/CMOS成像光学器件。

针对人体样品(尤其是血液)中痕量靶分子的可靠、灵敏、快速检测，是目前精准医学的重大需求。其中，数字化检测技术是目前的重点研发技术。数字化检测的核心过程是将待测样品均匀分配到大量的反应单元中，这些反应单元同时进行生化反应并进行结果检测。以针对核酸分子检测的数字PCR技术为例，策略是：将一个待测样品均匀分配到大量微小的反应单元中；然后，这些微小的反应单元同时进行PCR扩增反应，实现单拷贝或者多拷贝靶序列分子PCR扩增；扩增后，对每个反应单元检测到的荧光信号设定一个阈值，高于阈值时荧光信号的反应单元判读为1(“阳性”)，低于阈值时荧光信号的反应单元判读为0(“阴性”)。理论上讲，每个反应单元中靶序列分子(DNA模板)的分配存在三种可能性：零拷贝、一个拷贝或多个拷贝。当反应单元的数目足够大，大部分反应单元的内部只含有一个拷贝或者零拷贝靶序列分子(近似于泊松分布)，从而实现单拷贝靶序列分子PCR扩增。最后，通过统计阳性和阴性两种信号类型的反应单元比例和数目，并进行泊松统计学分析，最终计算出原始待测样本中的靶序列拷贝数。