[发明专利]一种基于双物质成分定性检测的桑树寄生质量控制方法

权利要求书

1.一种基于双物质成分定性检测的桑树寄生质量控制方法，其特征在于：包括如下步骤：

1.1薄层色谱法定性检测：

1.1.1样品前处理：

将采集到的样品：10个不同产地批次桑树寄生样品，柳树寄生、肉桂寄生2个样品，以及桑树、柳树和肉桂3个寄主的嫩枝4个样品，分别阴干，打粉过4号筛，备用；

1.1.2槲皮苷薄层鉴别：

1.1.2.1对照品溶液配制：精密称取槲皮苷对照品，加80％甲醇制成每1mL含0.42mg槲皮苷的溶液，作为对照品溶液；

1.1.2.2供试品溶液配制：精密称取过4号筛的药材样品粉末1.0g，加入80％甲醇超声提取45分钟，滤过，滤渣继续加等量原溶剂再超声提取45分钟，合并两次滤液，旋蒸浓缩并用80％甲醇定容到5mL，作为供试品溶液；

1.1.2.3显色剂配制：①3％三氯化铝乙醇溶液：称取3g三氯化铝，用乙醇溶解，再用乙醇定容至100mL；②10％硫酸乙醇溶液：量取硫酸57mL，加乙醇稀释至1000mL；③5％香草醛硫酸溶液：称取5g香草醛，用硫酸溶解并定容到100mL；

1.1.2.4展开系统的选择：分别吸取供试品溶液和对照品溶液各1μL，点于同一高效硅胶G薄层板上，分别在乙酸乙酯-环己烷-甲酸-水，5:1.2:2:0.3，V/V/V/V、乙酸乙酯-环己烷-甲酸-水，5:1.2:1.8:0.3，V/V/V/V和乙酸丁酯-环己烷-甲酸-水，5:1.2:1.8:0.3，V/V/V/V展开剂中展开，取出，晾干，以3％三氯化铝乙醇溶液显色法显色，于紫外灯365nm下检视；

结果显示：乙酸丁酯-环己烷-甲酸-水，5:1.2:1.8:0.3，V/V/V/V展开所得的斑点圆整，分离度好，具有好的重复性，乙酸乙酯-环己烷-甲酸-水，5:1.2:1.8:0.3，V/V/V/V和乙酸乙酯-环己烷-甲酸-水，5:1.2:2 :0.3，V/V/V/V也能分离，但有拖尾现象；

1.1.2.5显色方法的选择：分别吸取供试品溶液和对照品溶液各1μL，点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-环己烷-甲酸-水，5:1.2:1.8:0.3，V/V/V/V为展开剂展开，取出，晾干，分别喷以3％三氯化铝乙醇溶液、10％硫酸乙醇溶液和5％香草醛硫酸溶液为显色剂显色，晾干，于紫外灯365nm下检视，考察不同显色剂的显色效果；

结果显示：3％三氯化铝乙醇溶液显色剂显色，槲皮苷斑点清晰，10％硫酸乙醇溶液和5％香草醛硫酸溶液显色剂显色无法得到清晰斑点甚至看不到斑点；

1.1.2.6薄层色谱板的选择：分别吸取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别点于高效硅胶G和硅胶H不同薄层色谱板上，以乙酸丁酯-环己烷-甲酸-水，5:1.2:1.8:0.3，V/V/V/V为展开剂展开，取出，晾干，以3％三氯化铝乙醇溶液显色法显色，于紫外灯365nm下检视；

结果显示：高效硅胶G和硅胶H薄层色谱板都能得到理想的色谱图，但高效硅胶G板所得的斑点圆整，分离度好，具有好的重复性；

1.1.2.7点样量的选择：分别吸取供试品溶液和对照品溶液0.5μL、1μL、2μL，点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-环己烷-甲酸-水，5:1.2:1.8:0.3，V/V/V/V为展开剂展开，取出，晾干，以3％三氯化铝乙醇溶液显色法显色，于紫外灯365nm下检视；

结果表明：点样量为0.5μL～2μL均取得好的效果；

1.1.2.8验证试验：分别吸取10个不同产地批次桑树寄生供试品溶液和对照品溶液各1μL，点于同一高效硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-环己烷-甲酸-水，5:1.2:1.8:0.3，V/V/V/V为展开剂展开，取出，晾干，以3％三氯化铝乙醇溶液显色法显色，于紫外灯365nm下检视；

结果表明：10个不同产地批次桑树寄生样品均含有槲皮苷；

1.1.31-脱氧野尻霉素薄层鉴别：

1.1.3.1对照品溶液配制：精密称取1-脱氧野尻霉素对照品，加甲醇制成每1mL含0.46mg1-脱氧野尻霉素的溶液，作为对照品溶液；

1.1.3.2供试品溶液配制：精密称取过4号筛的药材样品粉末1.0g，加入50％乙醇100mL，回流提取2h，滤过，滤渣继续加等量的原溶剂再回流2h，合并两次滤液，旋蒸除去乙醇，提取液过732氢型强酸型阳离子交换树脂，用氨水洗脱，洗脱液旋蒸挥干，用甲醇定容到1mL作为供试品溶液；

1.1.3.3显色剂配制：①邻-联甲苯胺溶液：称取64mg的邻-联甲苯胺，溶解在6mL的冰醋酸中，用蒸馏水稀释至I00mL，与0.4％碘化钾溶液混合，1:1，V/V，现配现用；②3％三氯化铝乙醇溶液：称取3g三氯化铝，用乙醇溶解，再用乙醇定容至100mL；③10％硫酸乙醇溶液：量取硫酸57mL，加乙醇稀释至1000mL；

1.1.3.4展开系统的选择：分别吸取供试品溶液和对照品溶液各1μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，分别在正丁醇-冰醋酸-水，4.5:1.2:1.2，V/V/V、氯仿-甲醇-氨水，8:6:1，V/V/V、正丁醇-甲醇-氨水，4:10:1.8，V/V/V展开剂中展开，取出，晾干，以邻-联甲苯胺溶液显色法显色，自然光下检视；

结果显示：正丁醇-甲醇-氨水，4:10:1.8，V/V/V展开剂展开，所得的斑点圆整，分离度好，重复性佳；

1.1.3.5显色方法的选择：分别吸取供试品溶液和对照品溶液各1μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-甲醇-氨水，4:10:1.8，V/V/V为展开剂，展开，取出，晾干，分别用邻-联甲苯胺溶液、3％三氯化铝乙醇溶液和10％硫酸乙醇溶液显色法显色，其中邻-联甲苯胺溶液显色法，将展开晾干的薄层板先喷0.8％次氯酸钠溶液，自然晾干，再喷洒邻-联甲苯胺溶液，显色，自然光下检视；

结果显示：以邻-联甲苯胺溶液显色剂在自然光下检视，得到清晰集中的主斑点；

1.1.3.6薄层色谱板的选择：分别吸取供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别点于硅胶GF254、高效硅胶G不同薄层色谱板上，以正丁醇-甲醇-氨水，4:10:1.8，V/V/V为展开剂，展开，取出，晾干，以邻-联甲苯胺溶液显色法显色，自然光下检视；

结果表明：上述薄层色谱板中硅胶GF254薄层色谱板的样品斑点和对照品在一条线上，其余板样品与对照品颜色淡，得不到理想的色谱图；

1.1.3.7点样量的选择：分别吸取供试品溶液和对照品溶液0.5μL、1μL、2μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-甲醇-氨水，4:10:1.8，V/V/V为展开剂，展开，取出，晾干，以邻-联甲苯胺溶液显色法显色，自然光下检视；

结果表明：点样量为0.5μL～2μL均取得好的效果：

1.1.3.8验证试验：分别吸取10个不同产地批次桑树寄生、柳树寄生、肉桂寄生、桑树寄生的寄主、柳树寄生的寄主、肉桂寄生的寄主的供试品溶液和对照品溶液各1μL，分别点于两块硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-甲醇-氨水，4:10:1.8，V/V/V为展开剂，展开，取出，晾干，以邻-联甲苯胺溶液显色法显色，自然光下检视；

结果显示，桑枝、桑树寄生与1-脱氧野尻霉素对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，说明桑枝和桑树寄生均含有1-脱氧野尻霉素，柳枝、柳树寄生、桂枝、肉桂寄生则在1-脱氧野尻霉素对照品色谱点没有相应斑点，说明柳枝、柳树寄生、桂枝、肉桂寄生不含1-脱氧野尻霉素；

因此，1-脱氧野尻霉素为寄主桑树的特征性成分，桑树寄生的1-脱氧野尻霉素是由寄主桑树转移来的，通过对桑树寄生的1-脱氧野尻霉素进行薄层色谱鉴定，观察1-脱氧野尻霉素的有无，有效区别桑树寄生与其它非桑树寄主寄生。