[发明专利]一种人成体心源性间充质样干细胞的制备方法

说明书

本发明提供一种人成体心源性间充质样干细胞的制备方法，属于干细胞与再生医学技术领域。该方法包括以下步骤：1.人成体心耳组织的术中采集；2.从心耳组织中分离梳状肌；3.酶消化法分离心源性原代细胞；4.原代细胞培养、传代与扩增；5.鉴定细胞特征，获得所述人成体心源性间充质样干细胞。上述方法针对现有的心肌球源干细胞分离方法中需要较多操作步骤和较长培养时间等不足，提供一种操作简便，易于扩大规模且安全可控的心源性干细胞制备方法。可以降低由于细胞长期体外培养所获得的表型漂移和致瘤性变异等风险，提高细胞制备效率的同时增加了体外培养过程的稳定性。可用于建立体外干细胞模型、干细胞库及为临床个体化治疗提供备选种子细胞。

技术领域

本发明涉及干细胞与再生医学技术领域，具体涉及一种人成体心源性间充质样干细胞的制备方法。

背景技术

心肌损伤与修复再生一直是当代医学的一大难题。传统疗法能够拯救存活的心肌组织，但随着疾病的进展，最终不可避免发展为心力衰竭。近年来，以干细胞疗法为代表的再生医学为心脏再生领域带来了新希望。在心脏再生研究的干细胞类型中，以胚胎干细胞和诱导多能干细胞为代表的全/多能干细胞理论上可以分化为心房、心室和结样特性的细胞。但实际操作中有研究报导，与成年心肌细胞相比多能干细胞衍生的心肌细胞在结构和功能上都是未成熟的，未成熟心肌细胞或失调的电偶联导致心律失常是最紧迫的问题之一。此外，全/多能干细胞还存在以下临床应用困境：首先是免疫排斥、伦理、法律及宗教层面的限制；其次，全/多能干细胞的可塑性也是一把双刃剑，由于培养和诱导环境的问题，可能存在诱导不完全或诱导后变异等潜在致瘤性；最后，由于诱导技术的多环节质量控制较难，操作成本高，难以在临床开展和普及。与之相比，成体干细胞来源广泛，制备简单，无免疫排斥、致瘤以及伦理等问题，临床上便于实施个体化治疗。

目前用于心脏再生研究的成体干细胞主要有非心源性和心脏来源两种细胞类型。在非心源性干细胞中，脐带、脂肪和骨髓间充质干细胞是目前处于临床研究阶段中发展最为迅速的干细胞类型。心源性干细胞是一群来源于心脏组织，具备一定自我更新和心肌谱系分化潜能的细胞群。其中心肌球源性干细胞和特异性抗原(c-Kit⁺、Sca-1⁺等)干细胞的研究最为广泛。尽管最新研究否定了c-Kit⁺和Sca-1⁺干细胞在体内分化为心肌的能力，但心肌球源性干细胞在心脏再生中的积极作用已经被越来越多的动物及临床试验证实。目前，国际公认外源成体细胞的主要作用机制是对内源修复过程的调节作用，包括通过旁分泌(细胞因子、胞外囊泡等)，局部细胞之间(心肌细胞、免疫细胞、内皮细胞及成纤维细胞等)的相互作用调节血管生成、炎症反应、对抗凋亡及纤维化等病理过程。因此，由于心源性干细胞具备独特的组织特异性优势，是具有临床应用优势的种子细胞。然而，由于心脏是一个重要的组织器官，从心脏中安全并高效地获取心源性干细胞是一个关键性技术问题。首先，心脏组织取材对于制备心源性干细胞至关重要。心肌活检主要用于病因不明的心脏疾病诊断，此途径取材的心脏组织基本都是病态的。并且此方法对临床水平要求高，临床实施风险大。其次，心肌球源干细胞最常见的分离方法包括以下步骤：组织块培养、细胞球形成以及细胞球衍生细胞的扩增。其中，细胞球形成的目的是为了富集具有干性的细胞，但这也需要更多的操作步骤和较长的培养时间。因此，有必要提供一种不仅操作简便，并且安全和高效的心源性干细胞制备方法，可以降低由于细胞长期体外培养所获得的表型漂移和致瘤性变异等风险，提高细胞制备效率的同时增加了体外培养过程的稳定性。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种操作简便、安全高效的人成体心源性间充质样干细胞的分离提取与扩增筛选制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种人成体心源性间充质样干细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)心耳组织分离：取新鲜心耳组织，清洗去除血液，取其中梳状肌并剪碎为组织碎片，备用；

(2)组织消化：取上述组织碎片，采用优化的酶消化法分离原代心源细胞；