[发明专利]一种人成体心源性间充质样干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种人成体心源性间充质样干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)心脏组织分离：取离体的新鲜人的心耳组织，清洗去除血液，分离梳状肌并剪碎为组织碎片，备用；

2)组织消化：取上述组织碎片，采用酶消化法分离原代心源细胞；

3)细胞培养：将上述分离的细胞接种于培养皿中，以人成体心源性间充质样干细胞完全培养基进行培养，获得所述人成体心源性间充质样干细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述心耳组织源自患有瓣膜病合并房颤的人成体，在开胸手术中切除的心耳组织，并排除(即无瓣膜病合并房颤之外的心脏疾病)其它心脏疾病，其它心脏疾病如：心肌病、心肌炎或心脏肿瘤等。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述分离梳状肌质量应大于30mg；

所述组织分离步骤之前还包括心耳组织采集步骤：取离体的心耳组织置于PBS中，0-4℃存储或运输，离体2h内开始上述细胞制备。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述酶消化法包括以下步骤：

1)在组织消化液中将梳状肌剪至0.4-1.5mm³碎块；

2)加入组织消化液，进行首次震荡消化；

3)首次消化结束后，室温静置消化悬液3-5min，上层细胞悬液加入大于等于1倍(优选1-2倍)消化液体积的中和培养液，过滤去除未消化组织块后滤液于2-5℃暂存备用；再次加入组织消化液至下层未消化组织沉淀中，进行二次震荡消化；

4)再次消化结束后，加入大于等于1倍(优选1-2倍)消化液体积中和培养液并过滤去除消化不充分组织碎片，将上述两次所得滤液合并离心去除上清，获得细胞；所述组织消化液为：无钙、镁和酚红的PBS缓冲液，终浓度0.4±0.03％(优选0.4±0.01％)(g/ml)Ⅱ型胶原酶。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，Ⅱ型胶原酶组织消化液需要在组织消化前0.5-1h配置，并置于37-38℃空气中，100-150g恒温震荡备用；

步骤(4)所述离心条件为：2-5℃，1500rpm，5min。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，

步骤(2、3)中所述组织消化液的加入量为0.5±0.1ml组织消化液/mg梳状肌组织，优选第二次组织消化液加入量与首次相同；

步骤(2、3)所述消化条件为，首次消化：37-38℃，100-150rpm，震荡25-35min，二次消化：37-38℃，100-150rpm，震荡15-25min。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3、4)中所述中和培养液为2-5℃预冷的无血清DMEM/F12培养液；

步骤(3、4)所述过滤的方法为：细胞悬液经滴管滴加入孔径70μm细胞滤膜中，首次过滤后的滤液再按照相同的方式加入孔径40μm细胞滤膜中进行二次过滤。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述人成体心源性间充质样干细胞完全培养基由DMEM/F12培养基、终体积含量10±1％FBS和终浓度40-50ng/ml bFGF组成；

步骤(3)所述细胞培养步骤中，原代培养7-14天出现较大细胞克隆团时进行传代，随后每5-6天细胞汇合度为75-85％时进行传代培养，传至3代后可以获得10⁸数量级高纯度人成体心源性间充质样干细胞。

9.根据权利要求8所述的人成体心源性间充质样干细胞的制备方法，其特征在于，所述传代培养时按(1±0.2)×10⁴【优选(1±0.1)×10⁴】细胞/cm²底面积比例接种。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，

获得的人成体心源性间充质样干细胞的特征鉴定：

取上述传代培养的人成体心源性间充质样干细胞，进行表面标记分子和基因表达分析，证明所获得的人成体心源性间充质样干细胞的表型特征；

所述特征鉴定步骤中，检测传代培养获得的人成体心源性间充质样干细胞表面标记分子，CD105、CD29阳性率均应95％，CD31、CD45、CD34及HLA-DR阳性率均应5％，CD90阳性率在10％-90％之间；

所述特征鉴定步骤中，对传代培养获得的人成体心源性间充质样干细胞进行基因表达分析，心肌转录因子NKX2-5、GATA4基因均应表达，多能性基因Rex1、Sox2、Oct3/4、Nanog中至少表达三种。