[发明专利]一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法

说明书

本发明公开了一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，步骤包括：1）样品的收集与固定；2）醋酸铀块染；3）脱水、渗透和聚合；4）切片、染色后透射电镜检测。本发明与传统方法相比，极大的提升了样本制备的效率，使传统的5‑7天制样周期缩短至1天，并使一种快速检测病毒的超薄切片技术成为了可能。优化后的超薄切片电镜技术检测病毒，相比传统的病毒检测方法，大幅提高了病毒检测的特异性、准确性和检测效率。

技术领域

本发明涉及生物领域和医疗健康领域，特别是涉及生物制品安全性检测领域和未知病毒形态学快速检测和判断，具体涉及一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法。

背景技术

生物制品是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的产品。人用生物制品包括：细菌类疫苗（含类毒素）、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶、体内及体外诊断制品，以及其他生物活性制剂，如毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、抗原抗体复合物、免疫调节及微生态制剂等。

在生物制品的生产和应用过程中会遇到一些诸如安全性的问题。如抗体药物，单克隆抗体中小鼠杂交瘤细胞的使用，容易使单抗制品出现内源性病毒污染的可能；而多克隆抗体主用采用动物血清制备，也同样存在动物血清来源的安全性问题。目前，很多基因制品涉及蛋白表达载体的构建，这种构建的细胞系容易出现病毒感染的隐患。如疱疫病毒(EBV)转染的人成淋巴细胞系与小鼠骨髓瘤细胞融合后，其分泌的单克隆抗体容易出现小鼠逆转录病毒的感染。再者，基因重组蛋白制品所使用的表达细胞系本身含有内源性病毒，如中国仓鼠卵巢细胞自身存在内源性逆转录病毒，这也使得其分泌的蛋白存在安全隐患。作为生物制品的来源，均存在被细菌、病毒等微生物污染的可能性，因此在药品安全性问题上，生物制品与传统药品最大的不同是：生物制品存在内源性病毒污染的可能。因此，WHO、美国FDA、中国CFDA以及欧洲相关部门已经出具相应法规并规定：存在内源性污染的生物制品，在生产工艺中必须具备去除/灭活内源性污染的工艺，而且，必须对此工艺及产品进行生物安全性检测以排除生物制品制备工艺及产品潜在的病毒污染。

另外，医疗健康领域也需要进行病毒检测。病毒性感染可由多种病毒引起，但临床表现均有畏寒、发热、全身倦怠无力、食欲减退等全身中毒症状及受侵组织器官炎症的表现。人体的病毒性感染分为隐性感染、显性感染、慢病毒感染。多数情况下的感染呈隐性感染。少数为显性感染。显性感染中多数病毒性感染表现为急性感染，发病急、病程短，多在1～2周内自愈，少数表现为潜伏性感染（如疱疹病毒感染等）和慢性感染（如乙型肝炎病毒感染等）。

电子显微镜在病毒学研究中发挥着重要作用，尤其是在病毒粒子的鉴定、形态学研究和病毒检测方面，超薄切片透射电镜技术是一种最为直接和有效的方式来检测病毒颗粒的存在。无论是从病毒形态学和病毒发生学上，都能通过超薄切片电镜技术获得清晰和准确的结果。但由于传统的超薄切片样本制备方法复杂，周期较长，需投入大量的人力和时间成本，无法实现超薄切片电镜技术的快速检测，这也使得超薄切片电镜技术无法在竞争剧烈的制药领域内得到更好的应用。因此，根据传统方法的原理进行优化和创新，是解决当前问题的根本所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法。与传统方法相比，极大的提升了样本制备的效率，使传统的5-7天制样周期缩短至1天，并使一种快速检测病毒的超薄切片技术成为了可能。优化后的超薄切片电镜技术检测病毒，相比传统的病毒检测方法，大幅提高了病毒检测的特异性、准确性和检测效率。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种快速的细胞超薄切片电镜检测逆转录病毒的方法，该方法包括如下步骤：

I.样品采集，清洗后用戊二醛和锇酸双重固定；

II.醋酸铀块染；