[发明专利]基于Cre/Loxp系统的Ankle2基因敲除鼠模型的建立方法

权利要求书

1.基于Cre/Loxp系统的Ankle2基因敲除鼠模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将LoxP^1st插入到Ankle2基因的第二内含子里，在第五内含子里插入FRT-neo-FRT-LoxP元件；

(2)利用限制性内切酶及Southernblot筛选出中靶ES细胞克隆；

(3)随后将发生同源重组的ES细胞注射进C57BL/6J小鼠囊胚中，移入受体小鼠子宫，将得到的嵌合体雄鼠与C57BL/6J雌鼠交配获得Ankle2-Floxed小鼠；

(4)随后将Ankle2-Floxed小鼠与全身表达FLP酶的小鼠进行杂交，将打靶载体中的Neo基因去除，获得F1代小鼠，

(5)F1代小鼠自交并经PCR鉴定筛选出Ankle2^flox/flox F2代小鼠；Ankle2^flox/floxF2代小鼠与全身或组织特异性表达Cre酶小鼠进行杂交，PCR鉴定得到敲除Ankle2基因的杂合子F3代KO小鼠，F3代KO小鼠自交，后代经PCR和Western blot技术检测获得Ankle2基因纯合敲除的小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：采用KO First策略，把两个LoxP位点插入到Ankle2基因的第二内含子和第五内含子内，应用PCR技术从BAC克隆子RP24-96H15和RP23-24E20中将左右同源臂套取下来。

3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法为：转染前将酶切鉴定的打靶载体用NruⅠ酶切线性化，ES细胞用Ca²⁺/Mg²⁺free PBS重悬为单细胞状态，取细胞悬液加到电转杯中，加入线性化的打靶载体质粒，混匀室温放置，加入电穿孔槽中电转，将电转后的细胞完全转移到ES-DMEM中混匀，加入到含有feeder cells的培养皿上，24小时后加入G418，8-10天后挑取ES克隆，将挑取的单克隆放入到96孔板中，直至克隆数达到或超过196个为止，用排枪加入Trypsin/EDTA消化5分钟，并用移液器吹打至单细胞状态，转入到已换液的铺有feeder cells的96孔板中，视细胞的生长速度进行1比2传代，用于提取基因组DNA的细胞铺在0.1％gelatin coated的96孔培养板上，提取的基因组DNA分别用BstEⅡ和NsiⅠ酶切消化，缓慢电泳，随后用Neo探针行使Southern blot分析。