[发明专利]一种Cabs1蛋白抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种Cabs1蛋白抗体及其制备方法和应用，属于生物技术检测领域。针对目前商业化的Cabs1抗体均不能识别和检测小鼠Cabs1蛋白的表达，限制了利用小鼠模型研究Cabs1蛋白的功能与机制，本发明提供了一种可以用于Cabs1蛋白检测的多克隆抗体，其可以应用与Western Blot，免疫荧光，免疫共沉淀等多种用途，特异性高。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种Cabs1蛋白抗体及其制备方法和应用。

背景技术

精子发生异常是导致雄（男）性不育的重要原因，精子变形是精子发生过程的关键环节，因精子变形异常导致的男性不育临床上尚无有效的治疗手段。因此，阐明精子变形的精细机制对于雄（男）性不育研究具有重要意义。精子变形是指从圆形精子发育成为成熟精子的过程，其异常往往导致精子发生障碍进而诱发不育。目前，对精子发生早期阶段的研究比较广泛和深入，但对精子变形过程的研究比较匮乏，具体机制也不明确。Cabs1蛋白是在高等哺乳动物中保守的，特异性表达于长形精子到成熟精子阶段的钙离子结合蛋白。然而，目前尚不知道Cabs1蛋白的具体功能是什么。发明人前期利用Cas9技术研究了Cabs1基因敲除后小鼠精子的发生及生育情况，结果显示Cabs1缺失后大部分精子形态显著异常，小鼠生育能力明显降低，这提示Cabs1对于精子变形调控至关重要。

Cabs1蛋白的特异性抗体是研究其表达、定位及功能的重要工具。由于Cabs1基因序列与蛋白序列的保守性，理论上可以经过保守性和抗原系数分析后合成肽段作为抗原制备抗体。但目前市场上利用该方法制备的抗体经过反复尝试均不能用于小鼠Cabs1蛋白各种用途的检测。通过进一步分析后发现，Cabs1蛋白存在磷酸化、糖基化等多种修饰，这些修饰位点可能是物种特异性的。虽然该蛋白在序列上高度保守，功能可能也相似，但蛋白的翻译后修饰存在显著差异，这使得传统方法制备的抗体并不能跨物种使用。利用小鼠模型研究精子发生是目前最常用的方法，这对于揭示人类因精子发生异常而导致的男性不育疾病相关机制具有重要意义。因此，当前急需发明一种可以检测小鼠Cabs1蛋白表达、互作等多用途的抗体来满足基础研究的需要。

发明内容

针对目前商业化的Cabs1抗体均不能识别和检测小鼠Cabs1蛋白的表达，限制了利用小鼠模型研究该蛋白的功能与机制，本发明提供了一种可以用于Cabs1蛋白检测的多克隆抗体，其可以应用与Western Blot，免疫荧光，免疫共沉淀等多种用途，特异性高。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

Cabs1蛋白抗体，采用以下步骤制备得到：

步骤1，Cabs1编码序列的优化：利用密码子的简并性和偏好性原则，对Cabs1的编码序列进行优化，以利于蛋白的成功表达，优化后的序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤2，原核表达载体的构建：用NdeI和HidII内切酶对原核表达载体PET-30a(+)进行双酶切备用，用NdeI和HidII内切酶对原核表达载体PET-30a(+)进行双酶切备用，在优化后的Cabs1编码序列上加入酶切位点和多聚组氨酸标签，然后与载体连接，转化BL21(DE3)大肠杆菌，选取阳性菌株用于诱导Cabs1蛋白的表达；

步骤3，Cabs1蛋白的诱导表达与纯化：用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导Cabs1蛋白的表达，然后在37℃条件下扩大培养，培养12 h后收集细菌，提取蛋白，利用镍柱纯化目标蛋白，所述Cabs1蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤4，Cabs1抗体的制备：将Cabs1抗原蛋白与免疫佐剂一起免疫新西兰大白兔，经过三次加强免疫后，采集血清，对抗血清进行抗原抗体亲和纯化，得到Cabs1蛋白抗体。

进一步地，步骤2中诱导是用0.5 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷在37℃诱导4 h。

上述Cabs1蛋白抗体检测Cabs1蛋白中的应用。