[发明专利]一种基于RGO-CS-Hemin/Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法

说明书

一种基于RGO‑CS‑Hemin/Au NPs纳米复合材料检测GPC3的方法，采用电沉积技术以及静电吸附作用将RGO‑CS‑Hemin/Au NPs修饰在丝网印刷电极表面，将GPC3 aptamer负载在RGO‑CS‑Hemin/Au NPs材料表面，适配体因以单链结构的形式而呈不稳定的空间结构分布在生物传感界面上。在生物传感界面中加入GPC3后，GPC3能够与GPC3‑Apt特异性结合形成蛋白‑适配体复合物而呈稳定的空间结构，从而有序排列在工作电极表面，通过DPV法实现对GPC3的定量检测。该方法操作简单、省时、费用低且具有较低的检测限。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于电化学生物传感器检测GPC3的方法。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)是硫酸肝素蛋白聚糖的一种，粘附在细胞膜上，在肝细胞癌(HCC)中经常被发现升高。然而，GPC3在正常肝组织和良性肝损害中含量极低。因此，GPC3目前被用作诊断生物标志物用于HCC早期诊断和治疗。GPC3检测方法主要有放射免疫分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法、流式免疫分析法、电化学免疫传感器等。公告号CN 105717104 B的发明专利，涉及一种肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法。利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测GPC3表达情况。公布号为CN 106636108 A的发明专利，涉及一种靶向GPC3的核酸适配体及其应用。利用结合毛细管电泳的SELEX技术筛选与肝癌标志物GPC3特异性结合的核酸适配体，获得具有特异结合GPC3的适配体序列G625。所述的GPC3核酸适配体可用于设计、制备肝癌血清诊断试剂、肝癌组织切片染色试剂以及肝癌相关的活体成像造影剂。这些方法所用仪器昂贵、操作复杂、费时且技术要求高，需要建立一种快速、灵敏、操作简便的GPC3检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原氧化石墨烯-壳聚糖-血红素/纳米金（RGO-CS-Hemin/Au NPs）复合材料结合适配体来检测GPC3的方法，提高灵敏度、增强特异性。

为了解决该技术问题，采用电沉积技术以及静电吸附作用制作了基于RGO-CS-Hemin/Au NPs的GPC3纳米适配体电化学生物传感器。利用石墨烯及Au NPs对GPC3适配体的高负载能力和良好的电子传递效应，以及GPC3适配体对GPC3的特异性识别作用，采用电化学工作站的微分脉冲伏安法 (DPV)记录还原氧化石墨烯-血红素-壳聚糖（RGO-CS-Hemin）中血红素（Hemin）的峰电流变化值。对孵育温度、孵育时间、磷酸盐缓冲液（PBS）的pH值、GPC3适配体浓度以及RGO-Hemin-CS纳米复合材料的用量进行了优化，绘制了工作曲线，通过工作曲线计算得到实际检测样本中GPC3浓度。与现有的方法相比，操作相对简单，特异性高，时间和费用的消耗更少，能达到7.9 ng/mL的检测限。

本发明的检测原理为：采用电沉积技术以及静电吸附作用将RGO-CS-Hemin/AuNPs修饰在丝网印刷电极表面。通过纳米技术以及分子间作用力将GPC3适配体负载在RGO-CS-Hemin/Au NPs材料表面，此时适配体因以单链结构的形式而呈不稳定的空间结构分布在生物传感界面上。而后将GPC3蛋白导入到上述生物传感界面，因GPC3蛋白能与GPC3适配体发生特异性结合形成蛋白-适配体复合物而呈稳定的空间结构，从而有序排列在电极表面。以PBS溶液（0.2 mol/L， pH 6.0）为支持电解液，通过电化学工作站，使用循环脉冲伏安法（DPV）法检测RGO-CS-Hemin中Hemin的电化学信号变化值（扫描速率为0.01V/s，扫描的电压区间是0.2 V-1.2 V），并描绘出该电流与GPC3浓度的工作曲线，从而实现对GPC3的检测。

本发明按照以下步骤进行：

步骤1：RGO-CS-Hemin材料的制备