[发明专利]一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法及应用有效

专利信息
申请号: 201611121039.4 申请日: 2016-12-08
公开(公告)号: CN106582848B 公开(公告)日: 2019-09-17
发明(设计)人: 王桦;张立燕;姜耀;刘凤娟;刘敏 申请(专利权)人: 曲阜师范大学
主分类号: B01J31/22 分类号: B01J31/22;G01N33/574;G01N33/68
代理公司: 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人: 李桂存
地址: 273165 *** 国省代码: 山东;37
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摘要: 发明提供一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能的模拟酶的制备方法及应用。采用“一锅式”原位合成法,碱性条件下,将血红素与氯金酸混合,进而以血红素作为还原剂和稳定剂,实现金的原位生物矿化,制得具有Hemin过氧化物酶催化和金催化活性的Hemin‑AuNCs复合物;发挥其纳米导线功能,促进了Hemin催化反应的电子传输能力,同时增强了对底物的吸附能力,其催化活性显著高于常见Hemin(4倍以上);制备方法不涉及复杂光电仪器使用,具有催化活性高、操作简单、响应快速、成本低廉等优点。以癌症标志物甲胎蛋白的免疫分析为例,将该Hemin‑AuNCs复合物应用于标记AFP抗体,然后采用酶联免疫吸附法,通过酶催化和金催化银沉积信号放大途径,实现了对血液中癌症标志物甲胎蛋白的高灵敏检测。
搜索关键词: 一种 基于 血红素 金矿 途径 催化 功能 模拟 制备 方法 应用
【主权项】:
1.一种血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶在制备检测血液中癌症标志物甲胎蛋白的试剂中的应用,其特征在于:用于血液中癌症标志物甲胎蛋白的检测,包括酶联免疫吸附法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白和金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白;所述的通过酶联免疫吸附法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白具体方法为:通过酶催化TMB‑H2O2比色检测血液中癌症标志物甲胎蛋白,即采用Hemin‑ AuNCs复合物作为抗体标记物的ELISA比色检测方法,步骤为:1)建立待测样品校准曲线方程:ⅰ)取基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶,加PBS缓冲液配制为2mL 0.1‑0.4mg/mL的Hemin‑AuNCs溶液,然后加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺使其浓度分别为100 mM和80 mM,于20~25℃活化培育30 min;ⅱ)将步骤ⅰ)得到体系与AFP抗体溶液混合,使混合后AFP抗体浓度为3.0μg /mL,4℃孵育10~12h后,用柠檬酸缓冲液或PBS缓冲液洗涤,得到标记Hemin‑Au的AFP抗体,备用;ⅲ)向清洗干净的96孔板中加入10~40 μL质量浓度为0.5%的壳聚糖的柠檬酸缓冲液,20~25℃放置0.5~2 h,然后加入20 μL的质量浓度为2.5%的戊二醛的PBS缓冲液,20~25℃反应0.5~2 h;ⅳ)取AFP抗体溶液,采用PBS缓冲液配制为AFP抗体浓度0.25 mg /m L的AFP抗体稀释液,将步骤ⅲ)得到体系用PBS缓冲液清洗两次后,加入20 μL AFP抗体稀释液,20~25℃培养5~10 h;ⅴ)将步骤ⅳ)得到体系用PBS缓冲液清洗后,加入质量浓度为0.05~0.2%的牛血清白蛋白,然后于20~25℃培养1h以封闭非特异性蛋白结合位点;ⅵ)取AFP抗原溶液,分别加入到步骤ⅴ)得到体系中,配制为0.01~0.30 mg /mL浓度梯度的AFP抗原溶液,于37℃培养1 h后,分别用PBS缓冲液洗涤两次;ⅶ)将步骤ⅵ)得到各体系中,分别加入20μL步骤ⅱ)制备的标记Hemin‑Au的AFP抗体,37℃培养1 h,然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin‑Au的AFP抗体;ⅷ)分别向步骤ⅶ)得到各体系中,分别加入200μL TMB‑H2O2底物显色液,20~25℃反应20 min后,在波长652nm下测定吸光度值,建立AFP浓度‑吸光度校准曲线,得AFP校准曲线方程;2)检测待测人体血清样品甲胎蛋白含量:ⅰ)‑ⅴ)同步骤1);ⅵ)取待测人体血清样品,分别加入到步骤ⅴ)得到体系中,配制为0.05~55 ng /mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液,于37℃培养1 h后,分别用PBS缓冲液洗涤两次;ⅶ)将步骤ⅵ)得到各体系中,分别加入20μL步骤ⅱ)制备的标记Hemin‑Au的AFP抗体,37℃培养1 h,然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin‑Au的AFP抗体;ⅷ)向步骤ⅶ)得到各体系中,分别加入200 μL TMB‑H2O2底物显色液,20~25℃反应20 min后,在波长652nm下测定吸光度值,建立AFP浓度‑吸光度标准曲线,得AFP标准曲线方程,然后根据步骤1)AFP浓度‑吸光度校准曲线及AFP校准曲线方程,确定人体血清样品甲胎蛋白的含量;所述的金催化银沉积信号放大法检测血液中癌症标志物甲胎蛋白,即采用Hemin‑AuNCs复合物作为抗体标记物的金催化银沉积检测方法,步骤包括:1)建立待测样品校准曲线方程:步骤ⅰ)‑ⅴ)同上述方法;ⅵ)取AFP抗原溶液,分别加入到步骤ⅴ)得到体系中,配制为0.005~25 mg /mL浓度梯度的AFP抗原溶液,于37℃培养1 h后,分别用PBS缓冲液洗涤两次;ⅶ)向步骤ⅵ)得到体系中加入20μL步骤ⅱ)制备的标记Hemin‑Au的AFP抗体,37℃培养1 h,然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin‑Au的AFP抗体;ⅷ)向步骤ⅶ)得到各体系中,分别加入100 μL 浓度为50~120μg mL‑1的抗坏血酸溶液和100 μL 浓度为1.0~5.0 mg mL‑1的AgNO3水溶液,20~25℃反应5 min后,在波长410nm下分别测定吸光度值,建立AFP浓度‑吸光度校准曲线及其关系方程,即待测样品校准曲线方程;2)检测待测人体血清样品甲胎蛋白含量:ⅰ)‑ⅴ)同步骤1);ⅵ)取待测人体血清样品,分别加入到步骤ⅴ)得到体系中,配制为0.05~55 ng /mL浓度梯度的人体血清AFP抗原样品溶液,37℃培养1 h后,用PBS缓冲液洗涤两次;ⅶ)向步骤ⅵ)得到体系中加入20μL步骤ⅱ)制备的标记Hemin‑Au的AFP抗体,37℃培养1 h,然后用PBS洗涤两次除去未反应和非特异性吸附的标记Hemin‑Au的AFP抗体;ⅷ)向步骤ⅶ)得到各体系中,分别加入100 μL 浓度为50~120μg mL‑1的抗坏血酸溶液和100 μL 浓度为1.0~5.0 mg mL‑1的AgNO3水溶液,20~25℃反应5 min后,在波长410nm下分别测定吸光度值,建立AFP浓度‑吸光度标准曲线,得AFP标准曲线方程,然后根据步骤1)AFP浓度‑吸光度校准曲线及AFP校准曲线方程,确定人体血清样品甲胎蛋白的含量;所述的基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法包括以下步骤:(1)取氯化血红素,室温下加水搅拌,配制为浓度0.8 mg/mL的Hemin溶液,4℃储存;取氯金酸加水,配制为浓度10mM的 HAuCl4溶液;取NaOH加水,配制为浓度1.0 M的 NaOH溶液;(2)将步骤(1)制备的HAuCl4溶液与Hemin溶液各1.0 mL等体积混合,5 min后,温剧烈搅拌下加入120μL NaOH溶液,然后在37℃水浴中继续搅拌,反应8 h,8000 r/s离心20 min,取上清液采用规格为14 KDa的透析袋,去离子水透析12h处理,得基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶。
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  • 王松;许莹;夏建荣;罗震;龚翠然 - 中国科学院福建物质结构研究所
  • 2016-11-09 - 2019-09-20 - B01J31/22
  • 本发明公开了一种乙烯基交换反应用硅胶负载钯催化剂及其制备方法和用途,所述方法包括如下步骤:(1)首先制备含三烷氧基硅烷官能团的含N双齿螯合配体;(2)将步骤(1)制备得到的含N双齿螯合配体中的一种或多种与钯无机盐进行配位反应,生成钯配合物;(3)将步骤(2)制备得到的钯配合物与正硅酸烷基酯进行水解反应,生成所述的硅胶负载配位钯催化剂。所述制备方法容易进行,反应完全,金属钯利用率高;通过对反应原料的投料比进行控制,可以在一定范围内控制所制备的硅胶负载型钯催化剂中金属钯的负载量。所述催化剂可以有效地催化乙烯基交换反应,用于制备羧酸乙烯酯。
  • 一种三维多孔果渣碳支撑酞菁钴锂亚硫酰氯电池催化材料的制备方法及其应用-201910538493.7
  • 许占位;关伟伟;马冲;付豪;李康;赵怡星;孔硌;黄剑锋 - 陕西科技大学
  • 2019-06-20 - 2019-09-17 - B01J31/22
  • 本发明提出一种三维多孔果渣碳支撑酞菁钴锂亚硫酰氯电池催化材料制备方法及其应用,以邻苯二甲酸酐、六水合氯化钴、果渣碳和尿素为原料,钼酸铵为催化剂,在玻璃研钵中研磨均匀后放进马弗炉中固相烧结得到三维多孔果渣碳支撑酞菁钴锂亚硫酰氯电池催化材料,比表面积高,丰富的三维孔道结构和表面羧基化官能团能够增加离子活化表面积,加快电子传输;以三维多孔果渣碳支撑酞菁钴锂亚硫酰氯电池催化材料用于制备电池正极片,可以降低界面接触电阻,最终有效提高锂亚硫酰氯电池的电化学性;该方法具有制备工艺简单、成本低、制备条件易于控制、合成周期短、组成成分均匀等优点。
  • 铱基联吡啶-有机硅纳米管多相催化剂及制备方法-201610954986.5
  • 刘晓;张胜波;孙靖;王华;韩金玉 - 天津大学
  • 2016-11-03 - 2019-09-17 - B01J31/22
  • 本发明涉及一种铱基联吡啶‑有机硅纳米管多相分子催化剂及制备方法,有机硅纳米管里嵌入4,4’‑[4‑(三甲氧基硅烷)丁基]‑2,2’‑联吡啶配位二氯(五甲基环戊二烯基)合铱二聚体的复合物。将氯化钾、模板剂、有机硅烷前驱体1,4‑二(三乙氧硅基)苯、4,4’‑[4‑(三甲氧基硅烷)丁基]‑2,2’‑联吡啶依次加入盐酸溶液中,得到混合物;将混合物在乙醇与盐酸混合液中得到固体产物联吡啶‑有机硅纳米管;将联吡啶‑有机硅纳米管和二氯(五甲基环戊二烯基)合铱二聚体反应得到铱基联吡啶‑有机硅纳米管多相分子催化剂。催化剂有清晰的孔道结构,大的比表面积,而且为均相分子催化剂的固载提供了一种新的可行性方法。
  • 一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能模拟酶的制备方法及应用-201611121039.4
  • 王桦;张立燕;姜耀;刘凤娟;刘敏 - 曲阜师范大学
  • 2016-12-08 - 2019-09-17 - B01J31/22
  • 本发明提供一种基于血红素介导金矿化途径的双催化功能的模拟酶的制备方法及应用。采用“一锅式”原位合成法,碱性条件下,将血红素与氯金酸混合,进而以血红素作为还原剂和稳定剂,实现金的原位生物矿化,制得具有Hemin过氧化物酶催化和金催化活性的Hemin‑AuNCs复合物;发挥其纳米导线功能,促进了Hemin催化反应的电子传输能力,同时增强了对底物的吸附能力,其催化活性显著高于常见Hemin(4倍以上);制备方法不涉及复杂光电仪器使用,具有催化活性高、操作简单、响应快速、成本低廉等优点。以癌症标志物甲胎蛋白的免疫分析为例,将该Hemin‑AuNCs复合物应用于标记AFP抗体,然后采用酶联免疫吸附法,通过酶催化和金催化银沉积信号放大途径,实现了对血液中癌症标志物甲胎蛋白的高灵敏检测。
  • 一种疏水改性的核壳催化剂ZIF-67@SiO2用于肉桂醛转移加氢制备肉桂醇的方法-201910585234.X
  • 刘平乐;崔海帅;吕扬;熊伟;郝芳;罗和安 - 湘潭大学
  • 2019-07-01 - 2019-09-13 - B01J31/22
  • 本发明公开了一种疏水改性的核壳催化剂ZIF‑67@SiO2用于肉桂醛转移加氢制备肉桂醇的方法。该方法为在异丙醇存在的条件下,将疏水改性的核壳催化剂ZIF‑67@SiO2加入到肉桂醛加氢制备肉桂醇的反应中,控制反应温度为160~190℃,反应时间为12~18小时,反应压力为1~4MPa。本发明所得催化剂原料价格低廉,采用非贵金属,制备周期短,生产成本低,所得疏水改性的核壳催化剂ZIF‑67@SiO2用于肉桂醛加氢,不仅提高了ZIFs材料的稳定性,解决了ZIFs结构不稳定的问题,提高了催化剂重复使用的性能,并且其疏水性能也明显提升,从而能够较大程度上提高了肉桂醛的转化率和目标产物肉桂醇的选择性。
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