[发明专利]调节重组蛋白中甘露糖含量的方法

说明书

本发明涉及调节重组蛋白中甘露糖含量的方法，具体地调节(例如，降低)重组糖蛋白中的甘露糖含量，特别是高甘露糖含量的方法。

本申请是申请日为2007年01月23日的中国专利申请CN200780006761.6“调节重组蛋白中甘露糖含量的方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及调节(例如，降低)重组糖蛋白中的甘露糖含量，特别是高甘露糖含量的方法。

背景技术

高等真核生物进行各种翻译后修饰，包括甲基化，硫酸化，磷酸化，脂质添加和糖基化。这种修饰对蛋白的功能可能是极其重要的。分泌蛋白，膜蛋白，和被靶向囊泡或某些细胞内细胞器的蛋白，可能是被糖基化的。

N-糖基化是一种糖基化形式，其包括添加寡糖到蛋白中的识别序列(例如，Asn-X-Ser/Thr)中发现的天冬酰胺残基上。N-连接的糖蛋白包含标准的分支结构，其由甘露糖(Man)，半乳糖，N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和神经氨酸组成。蛋白N-糖基化一般发生于内质网(ER)，其中在多萜醇(一种脂质载体中间体)上组装的N-连接的寡糖(例如，GlC₃Man₉GlcNAc₂)，转移到新生蛋白的合适的天冬酰胺(Asn)上。这是所有真核生物的N-连接的糖蛋白共有的事件。存在两种重要类型的N-连接糖：高甘露糖寡糖和复合寡糖。

高甘露糖寡糖一般包括具有许多甘露糖残基(例如，大于4)的两个N-乙酰葡萄糖胺。复合寡糖如此命名，因为它们可以包含几乎任何数量的其它类型的糖，包括超过原始的两个N-乙酰葡萄糖胺。蛋白可以在蛋白的不同部分上被两类寡糖糖基化。寡糖是高甘露糖的还是复合的，据认为取决于在高尔基体中它对糖修饰蛋白的可及性，如果糖是相对难接近的，它将很可能保持它的原始高甘露糖形式。如果它是可接近的，那么可能许多甘露糖残基将裂解，而且糖将通过添加如上所述的其它类型基团而进一步被修饰。

寡糖链已经添加到蛋白以后，通过3个不同的酶以固定顺序除去3个葡萄糖和1个甘露糖残基。该事件发生在ER中，而且是蛋白可以被转运到Golgi用于进一步加工的一个信号。在ER中加工以后，形成高甘露糖型寡糖。3个葡萄糖残基和1个特定的α-1，2-连接的甘露糖残基被ER内的特异性葡糖苷酶和α-1，2-甘露糖苷酶除去，导致核心寡糖结构，Man₈GlcNAc₂。具有这种核心糖结构的蛋白转运到高尔基体中，糖部分在本文中进行各种修饰。

在哺乳动物细胞中，糖链修饰通过3种不同的途径进行，取决于其上添加的蛋白部分。3种不同的途径是：(1)核心糖链不改变；(2)通过添加UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)中的N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸盐部分(G1cNAc-1-P)到核心糖链中的甘露糖的6-位置，然后除去GlcNAc部分以形成糖蛋白中的酸性糖链，而使核心糖链改变；或(3)通过用甘露糖苷酶I除去3个甘露糖残基，核心糖链首先转变成Man₅GlcNAc₂；通过添加GlcNAc和除去另外的2个甘露糖残基，接着连续添加GlcNAc，半乳糖(Gal)，和N-乙酰神经氨酸(也称为唾液酸(NeuNAc))，以形成各种杂合的或复合的糖链(R.Kornfeld and S.Kornfeld，Ann.Rev.Biochem.54：631-664(1985)；Chiba et al.，J.Biol.Chem.273：26298-26304(1998))。

重组蛋白的寡糖含量能影响治疗糖蛋白的安全和功效。因此，用于控制这种糖蛋白的寡糖含量，尤其是甘露糖含量的方法将是有益的。

糖蛋白组合物，尤其是治疗抗体的高甘露糖含量，在治疗应用期间能显著地影响这些蛋白的安全和功效。不受特定理论的束缚，证据表明，由于例如，巨噬细胞和树突细胞上的甘露糖受体，高甘露糖糖蛋白比它们的低甘露糖对应物更快地从循环中清除。另外，高甘露糖糖蛋白预期更具有免疫原性。因此，生产具有低甘露糖含量的治疗糖蛋白，如例如治疗抗体，是合乎需要的。