[发明专利]一种角蛋白酶的异源表达及其在羊皮脱毛中的应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌角蛋白酶的异源表达与表征及其在羊皮脱毛中的应用，属于生物技术领域。本发明所述的角蛋白酶基因全长是通过挖掘Bacillus sp. LCB12全基因数据而获得，其基因全长1140bp，编码379个氨基酸，并通过PCR体外扩增了该基因。本发明为首次实现角蛋白酶VT104K基因在枯草芽孢杆菌SCK6中的异源表达、纯化和表征，并将重组角蛋白酶应用于山羊皮脱毛。该角蛋白酶具有良好的酶学特性，且脱毛性能优异，在制革工艺中拥有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种角蛋白酶的异源表达、表征及其在羊皮脱毛中的应用。

背景技术

角蛋白酶是一类能够降解角蛋白的蛋白酶类，其底物适用范围非常广，如纤维蛋白、乳清蛋白和酪蛋白等，并在饲料、皮革、医药业、食品等工业及环境治理方面具有广阔的应用前景。

皮革工业是一个拥有悠久历史的传统行业，其满足了社会对皮革制品的需求，创造了大量就业岗位，产生了巨大的社会和经济效益。但是，皮革工业也被认为是造成环境污染最严重的行业之一。而在制革工艺中，污染物主要来源于常规灰碱脱毛工艺，其产生的污染占BOD的40%、COD的50%、总污染的60~70%、高碱废水的100%。近十几年来，随着环保压力的增大，以及皮革清洁化生产的推广，酶法脱毛技术受到了越来越多的关注。酶法脱毛得到的裸皮粒面完整，成革的物理性能和机械性能良好。此外，脱毛废水中的BOD、COD、TSS和TDS也大幅度降低。

近年来，角蛋白酶脱毛引起了人们的广泛关注。与普通碱性蛋白酶相比，角蛋白酶具有更好的脱毛性能，且对皮革的损伤较低。同时，某些角蛋白酶对还原剂（S^2-、2-巯基乙醇和DTT）和极端环境表现出极强的抗性，而且角蛋白酶可以快速去除纤维间蛋白。因此，角蛋白酶脱毛在脱毛工序中展现了巨大的应用潜力。

发明内容

本发明首先提供了一种编码枯草芽孢杆菌角蛋白酶的基因，其是以一株分离自新疆维吾尔族自治区莎车县盐碱土壤样品的Bacillus sp. LCB12为出发菌株，并对菌株LCB12基因组数据进行基因挖掘，获得角蛋白酶基因。角蛋白酶基因全长1140bp（GenbankID：MG738728 ），编码379个氨基酸，其中1-29位氨基酸为信号肽，30-105位氨基酸为前肽，106-379位氨基酸为成熟肽。

本发明通过设计特异性引物，PCR扩增获得角蛋白酶基因，并通过酶切连接手段构建了重组质粒pMA0911-VT104K。将重组质粒转化至Bacillus subtilis SCK6实现了角蛋白酶的异源表达，并对重组菌发酵液进行硫酸铵分级沉淀和离子交换层析纯化获得了重组角蛋白酶。

本发明所得到的角蛋白酶的分子量约为30.95 kDa，该酶最适反应温度60 ^oC，最适反应pH为平pH 10，且在pH 4.5~11稳定性较好；PMSF完全抑制酶活，而EDTA微弱地抑制酶活；此外，还原剂DTT和β-ME对酶活有一定的促进作用。在蛋白酶用量为100U/mL，温度为33~35^oC的条件下，重组角蛋白酶VT104K能在6h内完成脱毛。角蛋白酶脱毛获得的裸皮洁白、光滑、柔软，粒面干净，毛孔清晰、完整。

附图说明

图1为重组质粒pMA0911-VT104K酶切鉴定：M：DNA Marker；1：pMA0911-vt104k；2：基因片段；3：酶切后质粒。

图2为角蛋白酶的电泳分析：M：蛋白Marker；1：纯化后的角蛋白酶。

图3为pH对角蛋白酶酶活(A)和稳定性(B)的影响。

图4为温度对角蛋白酶酶活(A)和稳定性(B)的影响。

图5为酶法脱毛效果。

具体实施方式