[发明专利]基于家蚕丝腺表达具有生物学活性的人结缔组织生长因子的方法及其产品和应用

说明书

本发明公开了基于家蚕丝腺表达具有生物学活性的人结缔组织生长因子的方法及其产品和应用，具体方法是将编码人结缔组织生长因子基因或N端含透皮肽的人结缔组织生长因子基因在家蚕丝腺表达，结茧后茧壳用尿素提取，纯化，得到具有生物学活性人结缔组织生长因子或N端含透皮肽的人结缔组织生长因子；该蛋白具有易于纯化，具有促进细胞增殖和透明质酸合成等生物学活性，该研究将加速CTGF作为功能性蛋白质药物在医学和医学美容领域中应用的进程，提供一种利用家蚕或其它生物反应器系统设计和生产高效的蛋白质药物的新策略。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及基于家蚕丝腺表达具有生物学活性的人结缔组织生长因子的方法，还涉及由该方法制得的产品和应用。

背景技术

人结缔组织生长因子，也称为CTGF或CCN2，是一种富含半胱氨酸的分泌型蛋白质，含有349个氨基酸，分子量为34～38KD。CTGF蛋白由四个保守结构域组成，即胰岛素样生长因子结合结构域、chordin样半胱氨酸富集结构域、血小板反应蛋白1型结构域和C端胱氨酸结结构域，因此具有多种生物学功能，参与了血管、皮肤、心脏、肾脏、胰腺、肺和肝等多种慢性疾病的组织纤维化过程。例如，促进损伤后肉芽组织的形成、再上皮化以及基质形成和重塑；通过Ras/MEK/ERK MAPK信号通路促进血管生成中的内皮增殖、迁移、存活和粘附以及伤口愈合；增加成纤维细胞和衰老皮肤组织中细胞外基质蛋白的产生(例如I型胶原、纤连蛋白及其整联蛋白受体)。这些结果表明，CTGF在新组织器官和结构的形成过程中起着重要作用，可以作为功能性药物用于医学和医学美容领域，以帮助受损皮下组织的再生和结构重建，从而迅速恢复其生物学功能。

生物反应器是一种高效、快捷的生产各种有价值的蛋白质药物的重要方法。该方法可以在短时间内获得大量的活性靶蛋白药物，并且具有以下特点：低成本和低工业污染。目前，已经成功开发了大肠杆菌、酵母、中国仓鼠卵巢和其它转基因植物、昆虫和动物的多种生物反应器系统，并成功生产了激素、抗体、疫苗、酶和其它多种蛋白质药物。此前，利用生物反应器的方法也成功生产过CTGF蛋白，例如，大肠杆菌生物反应器系统，该重组CTGF蛋白在I(50)约8pM时显着抑制血清剥夺诱导的鸡胚成纤维细胞凋亡；通过转染人仓鼠卵巢CTGF基因的cDNA改良的中国仓鼠卵巢细胞生物反应器系统，其生产的38kDa CTGF蛋白被忠实地糖基化并进行了有限的蛋白水解，并在体外以及皮下有效地促进了细胞粘附、有丝分裂和上皮细胞转分化。

家蚕的蚕腺是一种理想的可以用于构建生物反应器的组织器官，因为在家蚕幼虫五龄末期该器官能够大量合成蚕丝蛋白。目前，基于家蚕丝腺已成功开发了多种生物反应器系统，包括家蚕后部丝腺FibL表达系统、Fhx表达系统和FibH表达系统，这些系统将靶标蛋白表达于丝纤维的内部丝素层；家蚕前中部丝腺Ser1表达系统和Ser3表达系统，这些系统将靶标蛋白表达于丝纤维的外部丝胶层。因为位于丝纤维外部丝胶层的靶标蛋白易于分离和纯化，因此，家蚕中部丝腺生物反应器得到了快速地发展与优化，目前最优的家蚕中部丝腺表达系统由一个在家蚕神经系统与眼部特异性表达红色荧光蛋白的3xp3-DsRed-SV40转录调控单元、一个来自家蚕核型多角体病毒的Hr3增强子、一个来源于家蚕内源丝胶蛋白1基因的Ser1-P启动子和Ser1PA终止子组成。迄今为止，该系统已经成功地生产了包括人酸性成纤维细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、人血小板衍生生长因子、人乳铁蛋白和人转化生长因子在内的多种蛋白质药物，并且它们均具有生物学活性。