[发明专利]携载miRNA的VB12结合型纳米复合物的合成方法及应用

说明书

本发明公开了携载miRNA的VB12结合型纳米复合物的合成方法及应用。合成方法包括将PLGA‑PEG纳米复合物、维生素B12、EDC和DMAP混合溶解在无水溶剂A中，15～40℃下搅拌反应；反应完成后，透析、去除溶剂得到维生素B12结合型纳米复合物。本发明的合成方法，制备条件温和，所需原料廉价，操作方便，工艺简单，高效实用。制备得到的纳米复合物，从水溶性、稳定性及肿瘤靶向性三大方面优化了核酸药物，赋予其高效、低毒的抗肿瘤作用，在肿瘤治疗领域中有着广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种纳米药物的合成方法，特别涉及一种对肿瘤细胞具有更好靶向性的纳米药物的合成方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是一种长度约为22个核苷酸的小单链非编码RNA，其通过碱基互补配对的方式与靶基因的3’非翻译区(UTRs)结合，进而剪切靶基因的转录产物或者一直转录产物的翻译，最终起抑制转录后调控靶基因表达的作用。然而miRNAs本身是一个小分子核酸，在游离状态下核酸容易被血液中的核酸酶降解而失效，因此如何实现将miRNAs高效、靶向运输至肿瘤病灶是实现肿瘤治疗的关键。

传统的基因递送系统主要包括两大类：病毒载体和非病毒载体。其中，病毒载体具较高的转染能力，但是其毒性和病毒自身的不确定性使其临床应用受到很大限制；而非病毒型基因载体普遍存在着细胞毒性，容易被免疫系统捕获，导致其存在血液循环时间短、体内生物利用率低等问题。因此，设计并研发安全、高效、低毒的基因载体用于基因的递送成为基因治疗研究领域的焦点之一。近年来，纳米药物递送系统(Drug delivery system，DDS)受到越来越多的科研工作者的关注，在疾病预防、诊断和治疗等医疗干预中广泛应用，尤其在药物性能改善以及药物递送等领域作用突出。其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)由于其低免疫原性、生物相容性和生物降解性等特点，在临床和生物领域具有广泛的应用前景，同时其是一类被美国食品和药物管理局(FDA)批准的低毒材料。将PLGA和聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)进行耦联形成PLGA-PEG纳米载体，可以提高PLGA纳米载体的水溶性及生物相容性。

纳米载体是一种性能优异的药物递送系统，能在血液循环中通过肿瘤的透过性增强及滞留效应(permeability and retention，EPR)被动靶向至肿瘤病灶，但缺乏主动靶向性，在临床上的使用有一定的局限性。因此，亟需探索具有肿瘤靶向性的新型纳米复合物。

维生素B12(VB12)，又称甲钴胺，是一种人体必需的水溶性维生素，参与人体细胞代谢的甲基化、脱氧核酸(DNA)的合成、及核酸与蛋白质的合成等多个重要环节。肿瘤细胞的增殖和发育过程中，核酸和蛋白质的合成显著加快，因而VB12在肿瘤组织中具有一定的摄取靶向性。然而VB12的稳定性差，对光、热都很敏感，如何在温和的反应条件下将VB12偶联到纳米载体上是一项具有挑战性的工作。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种携载miRNA的维生素B12结合型纳米复合物的合成方法。

本发明所采取的技术方案是：

在一些实例中，所述PLGA-PEG纳米载体的合成方法包括：

1)将PLGA、NHS和EDC在无水溶剂B中混合，活化，充分反应后，使用无水溶剂C洗涤去除未反应的小分子，干燥得到PLGA-NHS球团；

2)将PLGA-NHS球团溶解在无水溶剂D中，加入双官能团修饰的NH₂-PEG-COOH和二异丙基乙胺，持续反应24小时；

3)反应结束后，用无水溶剂C洗涤，最后真空干燥得到PLGA-PEG纳米载体。

在一些实例中，所述一种维生素B12结合型纳米载体的合成方法包括：