[发明专利]一种过表达vault RNA 2-1基因质粒构建方法及其应用

说明书

发明公开了一种针对vault RNA 2‑1基因过表达重组质粒的构建方法及其在基因功能研究方面的应用。本发明涉及一种vault RNA 2‑1基因，并提供vault RNA 2‑1基因过表达重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)‑vtrna2‑1构建方法，以及在人结肠癌细胞中vault RNA 2‑1基因研究的实验方法。

技术领域：

本发明涉及一种过表达vault RNA 2-1真核重组表达质粒的构建方法及其应用。

技术背景

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化道常见恶性肿瘤之一，其发病率在全球居于恶性肿瘤第3位，死亡率高居第2位，是占全球发病和死亡首位的消化系统恶性肿瘤，严重威胁生命健康。近年来随着我国生活方式及饮食结构的西化，结直肠癌发病率总体呈现上升趋势，已成为我国消化系统发病率第2位、患病率第1位的恶性肿瘤。2018年预计我国结直肠癌新发病例超过52.1万，死亡病例约24.8万，新发和死亡病例均接近全世界同期结直肠癌病例的30％，疾病负担沉重。目前我国结直肠癌5年生存率远低于美国及日韩，85％以上的结直肠癌发现即已属晚期，即使经过手术、放化疗、靶向治疗等综合治疗，患者的5年生存率仍明显低于40％；相反，早期结直肠癌治疗后5年生存率可超过95％，甚至可以完全治愈。因此，早期诊断、早期治疗CRC尤为重要。目前，结直肠癌瘤的早期发生的分子机制尚未完全阐明，因此，深入了解结直肠癌的分子机理，对于研究开发癌症早期诊断治疗有重要作用。

基因工程，又称为基因重组技术，是二十世纪七十年代发展起来的在体外对DNA进行操作的一门技术，广泛用于疾病基础研究、基因治疗、基因免疫、基因疫苗等，其三要素分别为：酶、目的基因与载体。而真核表达载体是基因工程中用于构建真核基因表达系统的一种载体。近几十年来，各国学者围绕真核表达载体进行了各种疾病、基因等相关研究，在基因工程方面做了大量工作，为医学科学研究开辟了崭新途径。

非编码RNA是近年来出现的肿瘤发生发展的关键分子，其临床价值正受到密切关注。Vault RNA(vtrna)是一类84-141nt长的真核非编码RNA，由RNA聚合酶III转录。它们与形成穹窿颗粒的保守的穹窿蛋白相联系，这是一种复杂的结构，其在癌症中的功能和相关性至今仍不为人所知。人类vtrna家族包含vtrna1-1，vtrna1-2，vtrna1-3以及vtrna2-1四个亚型。不同的证据表明，vtrna2-1的表观遗传控制是复杂的，可能具有临床意义。乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、食道癌和胃癌的独立报告显示，其启动子在肿瘤组织中的甲基化程度与正常组织不同。

发明内容

本发明运用基因重组技术，针对vtrna2-1基因，构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-vtrna2-1，并将其转染人结肠癌上皮细胞，构建转染vtrna2-1基因的细胞株，为研究vtrna2-1基因功能提供良好的工具，亦为进一步研究vtrna2-1在结直肠癌的生物学功能奠定基础，同时为研究人结直肠癌或其他恶性肿瘤中vtrna2-1基因功能提供有效实验方法。

根据本发明的一个方面，本发明人提供了一种新颖的真核重组质粒及其制备方法，并证明了所述重组质粒是能够用于vtrna2-1基因功能研究的良好工具，并为研究人结直肠癌vtrna2-1基因功能提供有效实验方法。

vtrna2-1基因已在GenBank注册，注册号NG_051612.1，定位于5q31.1，全长108bp。本发明所述的真核重组质粒，其制备方法依次包括以下的步骤：

A)通过RT-PCR合成人的vtrna2-1基因片段；

B)将上述获得的核苷酸片段与真核质粒连接，该插入片段的酶切位点分别为HindIII和XhoI，将上述真核重组质粒转化到感受态细菌中培养，筛选正确插入的真核重组质粒克隆；

C)抽提真核重组质粒，利用限制性内切酶酶切图谱分析所建真核重组质粒。