[发明专利]基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法

说明书

本发明的目的是提供一种基于UPLC‑MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，采用液相色谱‑质谱联用技术手段，针对性的对参与能量代谢通路的关键代谢物进行定量检测，尤其是针对在TCA循环、糖酵解和氧化磷酸化通路的关键代谢物，该方法简单快速准确，免去了衍生化实验的繁琐，检测时不仅使用液相色谱发进行分离，同时采用质谱多反应监测模式的高特异性、高灵敏度分析策略，可一次进样分析得到多达20种重要能量代谢物的含量，具有高精度、前处理简单、灵敏度高、重复性好等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法。

背景技术

能量代谢维持着生命体最基本的生命活动，比如植物逆境和动物疾病通常伴随着严重的代谢紊乱，且大多归咎于能量代谢紊乱。能量代谢也影响着免疫细胞的功能和命运，与抗病和免疫应答有关。同时，蛋白质磷酸化的修饰基团来自于ATP，所以能量代谢异常可进一步导致上游蛋白质磷酸化通路的改变，严重影响生物体的各项生理、病理功能。生物体内的能量代谢过程主要包括三羧酸循环、糖酵解途径和氧化磷酸化过程。三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle)，又称为柠檬酸循环或TCA循环或Krebs循环，是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，分布在线粒体中；是三大营养素(糖类、脂类、氨基酸)的最终代谢通路；又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。糖酵解途径(glycolytic pathway)又称EMP途径，是将葡萄糖和糖原降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解的途径。EMP途径为生物体提供一定的能量，其中间产物为生物合成提供原料。氧化磷酸化过程，存在于真核细胞的线粒体或细菌中，是物质在体内氧化时释放的能量供给ADP与无机磷合成ATP的偶联反应。因此，能够全面直观的分析多种生物样本种与能量代谢通路相关代谢物含量，对研究与能量代谢紊乱相关疾病的生理、病理具有积极的指导意义。

目前能量代谢通路的关键物质的分析策略主要有三种，一种是对待测样品进行衍生化处理后再用气相色谱-三重四级杆质谱联用分析(中国专利CN 106855551 A)，由于该方法采用气相色谱进行分离，在检测前需要先用甲氧胺吡啶溶液重悬样品，再加入N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺进行衍生化反应才能进行色谱分离，导致样品制备时间过长，仅仅衍生化反应实验就要耗时至少3小时；第二种是使用带有二极管阵列检测器的高压液相色谱仪进行检测(中国专利CN 108303475 A)，该方法采用的二极管阵列检测器，灵敏度较差，仅能达到μg/mL级别，且该方法通过与标准品的色谱保留时间进行对比来对待测物进行定性，准确性较差，若检测样本过于复杂，就有可能出现干扰物来影响物质的定性分析，因此它无法成为一种能被广泛应用于多种样本类型的能量物质检测方法；第三种是采用商业化的试剂盒进行相关代谢物的检测，该方法检测费用高昂，实验步骤繁琐，对实验员的操作熟练度要求极高，且每次实验仅能进行单一物质的检测，具有很强的局限性。

发明内容

基于现有技术存在上述问题，本发明的目的是提供一种基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，采用液相色谱-质谱联用技术手段，针对性的对参与能量代谢通路的关键代谢物进行定量检测，尤其是针对在TCA循环、糖酵解和氧化磷酸化通路的关键代谢物，该方法简单快速准确，免去了衍生化实验的繁琐，检测时不仅使用液相色谱发进行分离，同时采用质谱多反应监测模式的高特异性、高灵敏度分析策略，可一次进样分析得到多达20种重要能量代谢物的含量，具有高精度、前处理简单、灵敏度高、重复性好等优点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，包括如下步骤：

步骤S1构建标准曲线，分别称取能量代谢物标准品，再使用50％乙腈水溶液配制成系列梯度浓度的能量代谢物标准品混合液，标准品混合液直接进行步骤S3和S4获得标准曲线；