[发明专利]基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法

权利要求书

1.基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1构建标准曲线，分别称取能量代谢物标准品，再使用50％乙腈水溶液配制成系列梯度浓度的能量代谢物标准品混合液，标准品混合液直接进行步骤S3和S4获得标准曲线；

步骤S2样品制备，取待测组织样本，加水制成组织匀浆，再加入甲醇/乙腈混合液，涡旋混合，冰浴中超声波处理，再孵育沉淀蛋白，高速离心取上清液，真空干燥，备用；

步骤S3液相色谱分析，取用乙腈水溶液复溶步骤S2获得的干燥样品，离心取上清进行液相色谱分析，色谱条件如下：

4℃进样，柱温45℃，流速为300μL/min；液相梯度如下：0-12min，B液从95％线性变化到76％；12-12.1min，B液从76％线性变化到47％；12.1-15.1min，B液从47％线性变化到95％，15.1-22min，B液维持在95％；

步骤S4质谱分析，步骤S3中色谱分离的样品直接进入质谱分析，质谱条件是，采用ESI源，离子源温度：450℃；雾化气压：45；辅助气压：45；气帘气：30；喷雾电压:-4500V，采用多反应监测模式检测。

2.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S1中的系列梯度浓度范围是1-50000ng/mL；所述的能量代谢物标准品包括乌头酸、二磷酸腺苷、α-酮戊二酸、一磷酸腺苷、三磷酸腺苷、柠檬酸、环腺苷酸、黄素单核苷酸、延胡索酸、5'-二磷酸鸟苷、5'-鸟苷酸、5'-三磷酸鸟苷、异柠檬酸、苹果酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、琥珀酸和磷酸三苯酯。

3.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S2中的水和甲醇/乙腈混合液先预冷至温度为4℃，所述的水为超纯水，所述的甲醇/乙腈混合液为体积比1：1的混合液，所述的超声波处理为350W处理20min，所述的孵育沉淀蛋白是-20℃孵育1h。

4.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S2和步骤S3的离心是14000rcf 4℃离心15min。

5.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S3中的使用50％的乙腈复溶干燥样品；所述的步骤S3中的A液为10mM的乙酸铵水溶液，pH9.2；所述的B液是10mM乙酸铵水溶液溶于85％乙腈水溶液，pH9.2。

6.根据权利要求1所述的基于UPLC-MSMS的组织能量代谢物质的分析方法，其特征在于，所述的步骤S4中质谱分析的代谢物定量离子对、定性离子对，及其相应的碰撞能信息如下：

代谢物	Q1(m/z)	Q3(m/z)	DP(V)	CE(V)	CXP(V)
乌头酸	173.1	85.1	-45	-16	-19
二磷酸腺苷	426	79	-100	-76	-15
一磷酸腺苷	346.1	79	-80	-60	-20
三磷酸腺苷	506	159	-100	-42	-20
柠檬酸	191	111.1	-50	-19	-15
环腺苷酸	328	134	-100	-30	-15
黄素单核苷酸	455.1	97	-100	-30	-15
延胡索酸	115.1	71.1	-50	-10	-20
5'-二磷酸鸟苷	442	79	-100	-95	-15
5'-鸟苷酸	362.1	79.1	-100	-60	-20
5'-三磷酸鸟苷	522	79.1	-140	-104	-15
异柠檬酸	191	73	-50	-30	-15
苹果酸	133	115.1	-42	-14	-15
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸	662.1	540	-100	-20	-20
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸	742.1	620	-90	-25	-20
磷酸烯醇丙酮酸	167.1	79	-50	-18	-15
丙酮酸	87.1	43.1	-50	-12	-9
磷酸三苯酯	423	302	-60	-20	-20
α-酮戊二酸	145.2	101.1	-50	-10	-15
琥珀酸	117.1	73	-47	-16	-15

选择特异性好的离子对作为定量离子对，并辅以定性离子对。