[发明专利]卵巢滤泡膜干细胞及其分离方法、培养方法和应用

说明书

本发明提供一种卵巢滤泡膜干细胞及其分离方法、培养方法和应用，涉及干细胞与组织工程技术领域。卵巢滤泡膜干细胞的分离方法，包括以下制备方法：获取卵巢组织：从生育力和卵巢功能正常，年龄为4～10岁的雌性食蟹猴，获取卵巢组织，剥离卵巢组织周围脂肪，保留卵巢皮质基质，清洗，将卵巢皮质基质剪成组织碎块；培养：向组织碎块中加入培养基，离心，弃掉上清液，加入培养液重悬，孵育，离心，弃掉上清液，加入培养液重悬，得到细胞悬液，接种培养，即得卵巢滤泡膜干细胞。本发明的方法可以成功分离卵巢滤泡膜干细胞，可以分化为卵巢滤泡膜细胞，可以提高血清AMH水平，提升卵巢功能。

技术领域

本发明涉及干细胞与组织工程技术领域，特别是涉及一种卵巢滤泡膜干细胞及其分离方法、培养方法和应用。

背景技术

随着生育年龄推迟，生活压力及环境因素影响，由性腺衰老导致的不孕不育现象明显增多。过去十年，我国育龄人群的不孕不育率已达到15％左右，每8对育龄夫妇中就有1对不孕不育患者。二孩政策的放开也给生殖健康带来了新的挑战：50％可生育二孩的女性年龄超过40岁高龄，导致生育力严重下降。同时卵巢衰老也直接加剧了人体的衰老速度。因此，如何有效治疗卵巢衰老，延缓机体衰老是我们面临的重要议题。生育力的核心之一是生殖细胞，它们也是生育力环节中最为重要的种子。同时，生殖细胞并不是孤立的，性腺体细胞增殖分化及激素分泌等功能的存在是维持生殖细胞正常发育的重要保障，因此，欲延缓衰老和重建生育力，为生殖细胞提供一个适宜发育的土壤微环境，也是至关重要的环节。

卵巢功能低下等系列疾病体现为卵子数量减少和/或质量低下、排卵障碍、不孕和生殖内分泌紊乱等问题，卵巢功能疾病主要包括卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)、卵巢储备功能降低(diminished ovarian reserve，DOR)、早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)和卵巢低反应(poor ovarian response，POR)等。以卵巢早衰为例，该疾病的诱因较为复杂，目前尚未完全清楚，已知影响因素主要包括：遗传学因素(如脆性X染色体等)、激素合成的相关代谢酶缺乏、蛋白及受体缺陷、免疫因素、感染因素、化疗放疗等医源性因素，这些因素往往加速卵泡闭锁。卵巢早衰的治疗方式主要是激素替代疗法、低温冻存卵子、卵巢移植、免疫疗法乃至心理治疗法等，这些治疗方式也存在一定的风险及副作用，目前没有特效的治疗方式，因此亟待寻求新的治疗方式。

卵巢滤泡膜细胞(theca cell，TC)是一群与雄性睾丸中分泌雄激素的睾丸间质细胞类似的细胞类型，是卵巢中合成雄激素的主要来源，产生的雄激素转运至颗粒细胞作为合成雌激素的底物，因此该细胞有可能成为治疗卵巢功能低下等系列疾病的种子细胞。卵巢滤泡膜干细胞(thecal stem cell，TSC)是一群具有自我更新能力的细胞类型，可分化为TC。目前对TSC的研究甚少，由于生物体内的TSC来源不明确，在卵巢中数量有限，已有报道从小鼠和猪全卵巢中可以分离得到TSC。灵长类动物与人类亲缘关系更为接近，其卵巢结构及生理周期与人类似，但其TSC的分离尚未见报道。已有的TSC的获取大多采用全卵巢分离的方式，损伤较大，也不利于开展自体移植治疗。

而本专利可采用微创获取猴卵巢皮层少量组织的方式，分离获得了TSC，并通过改良培养条件大量扩增该细胞并验证其功能，为后续该细胞的基础研究及临床转化应用研究提供研究基础，为进一步推动人类卵巢功能低下等疾病的治疗具有重要意义。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种卵巢滤泡膜干细胞的分离方法，可以成功分离出猴卵巢滤泡膜干细胞，该细胞具有再生修复病损组织的功能。

一种卵巢滤泡膜干细胞的分离方法，包括以下制备方法：

获取卵巢组织：选择年龄为4～10岁的雌性食蟹猴，从生育力和卵巢功能正常的食蟹猴卵巢获取卵巢组织，剥离卵巢组织周围脂肪，保留卵巢皮质基质，清洗，将卵巢皮质基质剪成组织碎块；