[发明专利]一种高纯度重组TRAIL的制备工艺

说明书

本发明公开了一种高纯度重组TRAIL的制备工艺，属于基因重组领域。包括菌体接种、发酵培养、补料培养、破碎收集、层析分离五个步骤。本发明通过基因重组的启动子结构进行研究，选取酸水解干酪素作为诱导营养组分，提高重组TRAIL的产量；通过亚铁离子作为螯合离子时，不仅能够达到较好的层析分离的效果，而且不会对大肠杆菌的生长的负面影响；通过研究补料方式合理控制营养组分的pH值，避免亚铁离子的转化为有毒物质，影响重组TRAIL的生物活性；通过对菌体粉碎、收集TRAIL做进一步优化，选取粗孔硅胶作为吸附介质，加大对对重组TRAIL的分离率。提高了TRAIL的产量和纯度。

技术领域

本发明属于基因重组领域，尤其是一种高纯度重组TRAIL的制备工艺。

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体( Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL) 作为潜在的抗癌药物，由281个氨基酸组成，属Ⅱ型跨膜蛋白，与TNF-a、FasL的氨基酸序列具有同源性，可诱导肿瘤细胞发生凋亡，但 TNF-a、FasL 对细胞具有毒副作用，无法应用于临床，研究显示TRAIL的114-281氨基酸胞外区片段具有可溶性，可明显的抑制多种肿瘤细胞系的凋亡，对正常组织及细胞毒性较小，通过与死亡受体相结合，启动cascade信号通路，活化Caspases，引起一系列细胞凋亡的特征，如染色体凝聚、凋亡小体、DNA 片段等。

由于TRAIL的临床使用量，通常百毫克级，需求量较大。然而，在制备高纯度重组TRAIL，需要通过大肠杆菌高密度的发酵，但是由于大肠杆菌细胞新陈代谢，对营养物质吸收、毒副产物的排出、氧气的吸收，均会导致培养体系发生变化，进而影响TRAIL的产量和纯度。因此，对于表达系统、高密度发酵工艺、蛋白纯化工艺的选择和优化以及质量控制均提出了较高的要求。

发明内容

发明目的：提供一种高纯度重组TRAIL的制备工艺，以解决上述背景技术中所涉及的问题。

技术方案：一种高纯度重组TRAIL的制备工艺，包括如下步骤：

步骤一、将冷冻储存的培养液以1%～5%的比例接入到培养基摇瓶中，在100～200rpm转速、30～40℃温度中搅拌0.5～1小时；

步骤二、将含有重组TRAIL基因的重组质粒的大肠杆菌以0.5%～10%的比例接种得到培养基摇瓶中；200～250rpm转速、30～40℃温度中发酵培养；

步骤三、在发酵培养8～10小时，取样检测并持续补料，始终保证培养基摇瓶pH为4.5～7.0；200～250rpm转速、30～40℃温度中发酵培养24～48小时；

步骤四、离心收集菌体，然后与缓冲溶液混合，在高压均质机中破碎，然后将裂解离心，收集上层清液，得到重组TRAIL蛋白悬浊液；

步骤五、经过多次层析，即可得到高纯度的重组TRAIL蛋白。

作为一个优选方案，所述培养液，以质量浓度计，包括如下组分：

胰蛋白胨 20～40g/L

酵母提取物 8～12 g/L

酸水解干酪素 8～12 g/L

葡萄糖 8～12 g/L

氯化钙 0.01～0.5 g/L

氯化钠 0.5～1.0 g/L

磷酸二氢钠 5～10 g/L

醋酸亚铁 0.02～0.05 g/L