[发明专利]一种重组O型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种塞内卡病毒重组核酸，其特征在于，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造，同时在塞内卡病毒cDNA的SphⅠ和NotⅠ酶切位点之间插入O型口蹄疫病毒的VP1基因；

对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造后的5'UTR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；插入的O型口蹄疫病毒的VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的重组核酸，其特征在于，所述塞内卡病毒株选自SVV/FJ/001株，所述SVV/FJ/001株的保藏编号为CCTCC NO.V201802。

3.权利要求1或2所述重组核酸在制备重组O型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡病毒重组核酸或塞内卡重组疫苗株中的应用。

4.一种包含权利要求1或2所述的重组核酸的重组O型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡重组病毒。

5.一种由权利要求1或2所述的重组核酸编码的重组O型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡重组病毒。

6.一种包含权利要求4或5所述的塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株。

7.权利要求4或5所述的塞内卡重组病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以O/BY/2010株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增得到O型FMDV的VP1基因；扩增所述VP1基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物OS-R，所述上游引物包括OVP1-F0和OVP1-F，所述上游引物OVP1-F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述上游引物OVP1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述下游引物OS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，利用特异性引物对分别扩增得到SVV/FJ/001株的S1片段和S20片段；扩增所述S1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-1R，所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F；所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述下游引物SVA-1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述SVV/FJ/001株的保藏编号为CCTCC NO.V201802；

扩增所述S20片段的特异性引物对包括上游引物SVA-2F0和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-2F0的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQID NO.10所示；

(3)将步骤(1)中获得的VP1基因片段与所述S20基因片段融合，得S2-OVP1片段；

(4)将所述S1片段和S2-OVP1片段分别与pMD20 T载体连接，得到亚克隆质粒PMD-S1和PMD-S2-OVP1；

(5)以所述亚克隆质粒PMD-S1为模板，用突变引物SVA-m5UTRF和SVA-m5UTRR进行扩增，得到亚克隆质粒PMD-mS1，所述SVA-m5UTRF的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述SVA-m5UTRR的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

(6)将质粒PMD-mS1用PacI和SphI双酶切、质粒PMD-S2-OVP1用SphI和NotI双酶切后，回收基因片段，连接替换插入到经PacI和NotI双酶切后的真核转录质粒prO/CHA/99中，得到重组质粒prSVV/FJ-M-OVP1；

(7)将得到的所述重组质粒prSVV/FJ-M-OVP1转染塞内卡病毒敏感细胞，获得重组O型FMDVVP1基因的塞内卡重组病毒。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)中利用引物OVP1-F和SVA-2R进行融合PCR，使基因片段融合；所述OVP1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述SVA-2R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。