[发明专利]一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种可溶性高效表达的rChGM‑CSF‑IFNα融合蛋白及其制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：（1）分别提取扩增鸡GM‑CSF和鸡IFN‑α基因；（2）将扩增后的鸡GM‑CSF和鸡IFN‑α基因连接，得到融合蛋白基因；（3）构建重组克隆载体和重组表达载体，筛选得到基因工程菌；（4）融合蛋白的可溶性高效表达；（5）融合蛋白纯化。本发明通过ChGM‑CSF‑IFNα融合表达，提高了单纯ChIFNα的抗病毒活性，且延长了单纯ChIFNα在体内的药物半衰期，且通过ChGM‑CSF‑IFNα原核可溶性高效表达，有效解决了鸡GM‑CSF和鸡IFN在家禽养殖业的应用成本问题。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种可溶性高效表达的rChGM-CSF-IFNα融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

随着近年来全球畜禽养殖业的迅猛发展，我国养鸡业已由农村家庭副业发展成了一大社会产业。然而，鸡的病毒性传染病，如新城疫、传染性法氏囊病、马立克氏病、传染性支气管炎和禽流感等，每年都会在不同的季节暴发。鸡群一旦感染发病，会造成鸡的大面积死亡，给养殖业造成巨大经济损失。目前鸡类病毒性传染病的防治主要采用疫苗免疫和药物治疗。由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒的血清型复杂，毒株变异快，常导致疫苗免疫失败。且很多病毒性疾病目前尚无疫苗可用，有些病毒如禽流感已直接危害到人类的健康。动物用抗病毒药物种类则更加匮乏，临床治疗主要采用抗生素。但是近年来由于抗生素滥用，导致耐药性菌株大量产生，并通过食物链传染给人，给人类健康带来更大的威胁。

IFN(干扰素)是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的繁殖。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥作用的不同，分为α、β、γ三类。现已知，α型IFN在体内可有选择性地作用于病毒等感染的细胞，通过抑制受染细胞内病毒蛋白质的合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。IFN-α主要具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、激活免疫细胞的杀伤活性等生物学活性。

GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)是一种细胞因子，主要由淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞和巨噬细胞等产生，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞形成集落，并可促进早期巨核红细胞、嗜酸性祖细胞的增殖和发育。1977年Burgess等首次从小鼠的肺细胞培养液中发现一种能促进粒细胞和巨噬细胞形成集落的细胞因子，并将其命名为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，该细胞因子在机体免疫反应中发挥着重要的作用，不仅能够活化巨噬细胞、树突状细胞以及其他单核细胞，还能促进造血干细胞的增殖分化并在成熟时将其转移至外周。

GM-CSF在机体免疫应答过程中发挥着重要的作用，并作为疫苗佐剂被广泛使用。1993年Dranoff等首次使用GM-CSF作为抗肿瘤疫苗免疫效应增强剂。1999年SomasundaramC等首次将pGM-CSF作为伪狂犬病病毒(PRV)DNA疫苗佐剂，有效增强了疫苗的免疫效力。近些年来，又有研究报道了pGM-CSF在口蹄疫病毒(FD-MV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等疫苗中具有良好的增强免疫效应。

现已知，天然鸡IFN-α、重组鸡IFN-α及重组GM-CSF在体内的半衰期均较短，一般为3～5小时。这给临床治疗带来了诸多不便，如治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，也影响疗效并增大了机体不良反应发生的概率。聚乙二醇修饰的干扰素虽然能延长半衰期，但是聚乙二醇修饰的干扰素成本非常高，在家禽临床治疗上很难得到应用。