[发明专利]一种用于检测2019新型冠状病毒的冻干型荧光RT-PCR试剂及方法

说明书

本发明提供了一种用于检测2019新型冠状病毒的冻干型荧光RT‑PCR试剂及方法。该试剂所含的2019新型冠状病毒的特异性引物和探针从设计上避免了引起假阴性、假阳性和降低反应效率的各种因素，试剂的反应体系经过优化以提高反应效率，并通过冷冻干燥技术制成常温下稳定的冻干型试剂，避免了常规液体试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险。

技术领域

本发明涉及病原微生物的检测技术，具体地说涉及2019新型冠状病毒的核酸检测试剂和方法。

背景技术

冠状病毒是自然界广泛存在的一大类病毒，经感染可引起人的呼吸道、消化道和神经系统疾病。冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科，可分为α、β、γ、δ四个属，基因组均由线性单股正链的RNA组成。目前已发现7种可感染人类的冠状病毒，即α属的HCoV-229E和HCoV-NL63，以及β属的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、 SARS-CoV、MERS-CoV和2019新型冠状病毒(2019-nCoV，又称“SARS-CoV-2”)。

2019新型冠状病毒所致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)属于《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。以荧光RT-PCR为代表的核酸检测技术是2019新型冠状病毒确诊的主要方法。 2019新型冠状病毒疫情爆发后，世界卫生组织(WHO)公开发表了多套新型冠状病毒荧光RT-PCR检测的引物和探针序列，但是这些设计普遍存在明显的缺陷，包括Tm值不合理、探针与引物的相对位置不合理、存在稳定的二级结构(特别是稳定的探针发夹结构)等。目前一些按这些引物探针设计开发的检测试剂盒在实际检测中存在检测灵敏度低、漏检率高的问题，可能与其设计上的缺陷密切相关。此外，现有的2019新型冠状病毒荧光RT-PCR检测试剂均为常规的液体试剂，需要在冷链(-20℃)条件下运输和保存，保存、运输和使用过程中的温度升高、反复冻融都会造成试剂的检测性能下降，影响检测灵敏度。

现有的2019新型冠状病毒荧光RT-PCR检测试剂准确性不足，且对冷链有苛刻的要求。2019新型冠状病毒的防疫工作需要一种更准确可靠，最好无需冷链的2019新型冠状病毒荧光RT-PCR检测试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种从引物和探针设计上尽量提高准确性和扩增效率、且无需冷链的2019新型冠状病毒冻干型荧光RT-PCR检测试剂及方法。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：

1.引物和探针的设计及反应体系

为从设计上提高准确性，本发明中用于检测2019新型冠状病毒核酸的荧光 RT-PCR引物探针组合是基于GISAID、NMDC和GenBank数据库最新的2019新型冠状病毒核酸序列信息设计、筛选而得出。其序列如下：

正向引物2019-nCoV-F：5’-CAGCGTTCTTCGGAATGTCG-3’；

反向引物2019-nCoV-R：5’-CCAATTTGATGGCACCTGTGTAG-3’；

探针2019-nCoV-P：5’-CAACCACGTTCCCGAAGGTGTGACTT-3’。

探针2019-nCoV-P的5’端用荧光报告基团标记，3’端用荧光淬灭基团标记。荧光报告基团优选FAM，还可以选用VIC、HEX、JOE、NED、TET、ROX和CY5 中的任意一种；荧光淬灭基团优选BHQ1，还可以选用BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse 中的任意一种。

本发明的2019新型冠状病毒荧光RT-PCR检测试剂的成分组成如表1所示，加待测RNA样本和水至25μl的反应体积即可上机检测。

表1.2019新型冠状病毒荧光RT-PCR检测试剂成分