[发明专利]半胱天冬酶生物传感器及应用、半胱天冬酶活性的检测方法

说明书

本发明公开了半胱天冬酶生物传感器及应用、半胱天冬酶活性的检测方法，半胱天冬酶生物传感器，包括磁珠、检测探针、环形模板、DNA聚合酶、二级引物；磁珠表面包覆链霉亲和素；检测探针包括连接的肽底物结构域和DNA引物结构域，肽底物结构域为氨基酸序列，DNA引物结构域为单链DNA序列；肽底物结构域含有特异位点，特异位点能够被半胱天冬酶识别并切割，特异位点与连接位点距离n个氨基酸，连接位点是肽底物结构域和DNA引物结构域的连接处，肽底物结构域连接生物素连接，特异位点位于生物素与连接位点之间，n为小于10的自然数；DNA引物结构域能够与环形模板、DNA聚合酶、二级引物配合进行分支滚环扩增反应。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，涉及半胱天冬酶生物传感器及应用、半胱天冬酶活性的检测方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

细胞凋亡是重要的程序性细胞死亡过程，通过消除机体不需要的细胞来调节一系列重要的生理过程和应激反应。半胱氨酸天冬氨酰特异性蛋白酶(半胱天冬酶)被认为是细胞凋亡的主要执行者，可以通过有效裂解特定的细胞底物(例如聚ADP-核糖聚合酶和核纤溶酶)导致细胞凋亡。半胱天冬酶的活性异常可能会影响正常的细胞凋亡调节系统，并导致许多人类疾病如阿尔茨海默氏病、肝胆疾病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)以及多种癌症的发生。

据本发明的发明人所知，检测半胱天冬酶活性的方法有质谱法、高效液相色谱法、免疫组化分析法和免疫印迹法，但是这些方法存在步骤繁琐、测定时间较长、测定程序复杂以及抗体昂贵的问题，这可能会极大地限制它们的广泛应用。目前，已经开发出了多种基于电化学测定、表面增强拉曼散射测定、比色测定、生物发光测定或荧光测定的新策略，可以有效地检测半胱天冬酶的活性。其中，荧光方法因操作简便、灵敏度高和具多路复用能力的突出优点而最受欢迎。然而，经过本发明的发明人研究发现，这些荧光检测方法经常使用荧光标记(包括荧光蛋白和有机染料等)和淬灭标记的肽作为酶的底物来检测半胱天冬酶的活性，不仅增加了测定成本和探针合成的复杂程度，还可能因为荧光的不完全淬灭导致假阳性信号；同时，目前荧光法对于半胱天冬酶活性的检测灵敏度仍然较低。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供半胱天冬酶生物传感器及应用、半胱天冬酶活性的检测方法，不仅能够避免荧光标记，而且能够大大提高检测半胱天冬酶活性的灵敏度。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种半胱天冬酶生物传感器，包括磁珠、检测探针、环形模板、DNA聚合酶、二级引物；所述磁珠表面包覆链霉亲和素；所述环形模板为环形单链DNA序列，所述二级引物为单链DNA序列；

所述检测探针包括连接的肽底物结构域和DNA引物结构域，所述肽底物结构域为氨基酸序列，所述DNA引物结构域为单链DNA序列；肽底物结构域含有特异位点，所述特异位点能够被半胱天冬酶识别并切割，所述特异位点与连接位点距离n个氨基酸，所述连接位点是肽底物结构域和DNA引物结构域的连接处，所述肽底物结构域连接生物素，特异位点位于生物素与连接位点之间，所述n为小于10的自然数；

所述DNA引物结构域能够与环形模板、DNA聚合酶、二级引物配合进行分支滚环扩增反应。

核酸扩增技术是最直接、最有效的靶信号扩增方法，一系列扩增策略如聚合酶依赖性扩增策略(如聚合酶链式反应、链置换扩增反应和依赖解旋酶DNA等温扩增)、连接酶信号扩增策略、核酸酶(核酸内切酶、核酸外切酶和其他核酸酶)辅助的信号放大策略和无酶信号放大策略等已成功应用于高灵敏生物传感领域。然而，半胱天冬酶的活性信号或其切割产物的信号不能像核酸一样被直接扩增，因而半胱天冬酶无法采用核酸扩增进行检测。