[发明专利]以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法

说明书

本发明公开一种以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法，是以Direct Blue 71染色液对印迹有目的蛋白质的PVDF膜进行染色，使用甲醇进行脱色、激活，关键是在胰酶消化前采用聚乙烯醇溶液浸泡PVDF膜，实现对PVDF膜的亲水化处理，解决了酶蛋白吸附在膜表面而不能进入膜内部影响酶切或β‑游离反应效率的问题。聚乙烯醇溶液低廉且不会对糖链解析图谱产生干扰，无需经过反复洗涤将其去除，具有操作简单，省时省力、降低成本、提高提取效率等优点，可避免糖蛋白因反复洗涤而丢失，重复性好，提高了糖链提取准确率。本发明有效提高了检测灵敏度，可从仅40 ng糖蛋白中检测出与原液中完全相同数量的糖链。

技术领域

本发明涉及一种糖链提取方法，尤其是一种操作简单、重复性好，可有效提高准确率及灵敏度的以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法。

背景技术

糖蛋白依据糖链结构(N-连接聚糖或O-连接聚糖)和糖基化位点的不同，主要分为N-糖蛋白和O-糖蛋白两大类，从糖蛋白上提取糖链必须先将目标糖蛋白纯化出来。糖蛋白多定位于细胞表面(属于膜蛋白)，水溶性差，其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之一。以往常采用制备质膜，然后用CHAPS等去污剂释放或TritonX-114相分离、有机溶剂萃取等提取粗糖蛋白，然后经过透析、超滤、电泳和层析等方法对粗糖蛋白分离纯化，但是所得产物基本是混合蛋白的聚糖混合物，若要得到某单一蛋白质的糖链，就必须将目的糖蛋白有效地分离纯化出来。目前，经常使用IP方法从细胞或组织裂解液中分离出目的糖蛋白、抗体及一些其他非特异性作用蛋白的混合溶液，再将含有目的糖蛋白质的混合溶液进行PAGE电泳分离，然后将目的蛋白凝胶条带切下，在凝胶内进行酶解或酸水解后提取目的糖蛋白糖链，或者将被分离的蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上，再从PVDF膜上进行糖链提取，即以PVDF膜为载体提取糖链。

现有以PVDF膜为载体提取糖链的方法是使用凝胶将蛋白质进行梯度分离；将已梯度分离的蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜；将印迹有目的蛋白质的PVDF膜进行染色；脱色经染色的PVDF膜；晾干脱色后的PVDF膜；用水清洗从PVDF膜剪下的载有目的蛋白质部位的PVDF膜碎片上灰尘；将PVDF膜碎片转移至EP管内；用甲醇等浸泡PVDF膜碎片；去除浸泡液，向PVDF膜碎片中加入NH₄HC0₃溶液及胰酶溶液进行孵育；停止胰酶消化反应；根据目的糖链类型进行糖链释放反应：如进行N-糖链提取，往EP管内加入PNGase F酶进行孵育；若进行O-糖链提取，则先将灭活的胰酶溶液冻干，再向EP管内直接加入等体积的NaOH和NaBH₄混合溶液进行孵育。由于PVDF膜本身疏水性极强(与蛋白质之间主要是通过疏水键结合)，很容易直接将酶蛋白吸附到膜表面，使酶蛋白不能进入膜内部，影响了酶切或β-游离反应效率。为了提高酶切或β-游离反应效率，已有在酶液消化前用聚乙烯吡咯烷酮40000(Polyvinylpyrrolidone，PVP-40)事先处理PVDF膜的相关报道，但由于PVP-40为胶状溶液，处理后需要对PVDF膜反复多次用清水洗涤，以去除PVP-40产生的污染物对糖链解析图谱产生干扰。反复洗涤不仅费时费力、提高操作成本、影响提取效率，而且还会使存量不多的糖蛋白丢失，重复性差，降低糖链提取准确率。另外，即使反复洗涤仍会残余PVP-40，难免出现干扰糖链解析图谱的现象。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、重复性好，可有效提高准确率及灵敏度的以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法。

本发明的技术解决方案是：一种以PVDF膜为载体准确提取糖链的方法，依次按照如下步骤进行：

(1)使用凝胶将蛋白质进行梯度分离；

(2)将已梯度分离的蛋白质从凝胶印迹到PVDF膜上；

(3)将印迹有目的蛋白质的PVDF膜浸泡在Direct Blue 71染色液中进行染色；

(4)用甲醇脱色经Direct Blue 71染色的PVDF膜；