[发明专利]一种原位荧光标记地杆菌的方法

说明书

本发明提供了一种原位荧光标记地杆菌的方法，将PpFbFP荧光蛋白基因转入地杆菌，本发明的PpFbFP荧光蛋白标记不受氧气的影响，可以在厌氧条件下使得被标记的地杆菌菌株发荧光，且半衰期长，能够实现长期实时观察地杆菌的运动轨迹、成膜过程及群体行为。

技术领域

本发明涉及一种原位荧光标记地杆菌的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

地杆菌(Geobacter)是自然环境中数量最多、分布最广的电活性细菌，也是研究最为广泛、电子转移活性最强的电活性模式菌株，广泛分布于淡水沉积物、有机物及重金属污染的地下水沉积层等厌氧环境，具有铁还原、腐殖质还原与产电三大功能。由地杆菌形成的电活性生物膜在环境修复及生物工程方面有重要的应用价值，可实现处理污染物的同时产出电能或其他化学制品，有助于污染修复技术向低投入、低能耗、低污染的方向转型。利用原位荧光蛋白标记技术，实时的探究地杆菌生物膜形成的动态过程及细菌间的群体行为，对促进地杆菌电活性生物膜的形成、提高其环境及经济效益具有重要的意义。

目前，原位荧光蛋白标记的方法在研究基因的调控及蛋白的合成、折叠、定位、运动和相互作用等方面已经得到广泛的应用。其中，一种来自维多利亚多管发光水母绿色荧光蛋白(GFP)应用最广泛。然而，其发色光团的合成需要氧分子作为必须的辅因子，因此无法在厌氧菌地杆菌中应用。此外GFP的半衰期较短，这也使其在长期原位观察生物膜的形成过程中受到限制。因此，寻找一种能够在厌氧条件下发光且半衰期较长的荧光探针及其标记方法是解决当前地杆菌无法进行原位荧光标记的有效策略。

发明内容

本发明提供了一种原位荧光标记地杆菌的方法，可以有效解决上述问题。

本发明是这样实现的：

一种原位荧光标记地杆菌的方法，将PpFbFP荧光蛋白基因转入地杆菌。

作为进一步改进的，所述PpFbFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示。

作为进一步改进的，所述地杆菌为Geobacter sulfurreducens菌。

作为进一步改进的，包括以下步骤：

S1，采用质粒pUC19构建含有PpFbFP荧光蛋白基因的质粒 pUC-PpFbFP；

S2，将步骤S1构建的质粒pUC-PpFbFP转入Geobacter sulfurreducens 菌。

作为进一步改进的，所述质粒pUC-PpFbFP在构建时插入ompJ的强启动子。

作为进一步改进的，所述质粒pUC-PpFbFP在构建时还插入庆大霉素抗性基因。

作为进一步改进的，所述PpFbFP荧光蛋白基因插入质粒pUC19的位点GSU0808与GSU0807之间。

作为进一步改进的，步骤S2具体为：

A，使用限制性内切酶ScaI单酶切质粒pUC-PpFbFP使其线性化，并将线性化质粒进行浓缩；

B，在厌氧条件下，将培养至对数期的Geobacter sulfurreducens PCA 4℃预冷后，离心并收集菌体，并用4℃预冷的电转Buffer洗涤菌体两次，制备Geobactersulfurreducens PCA感受态；

C，取浓缩后的线性化质粒pUC-PpFbFP加入到Geobacter sulfurreducens PCA感受态细胞悬浮液中，混匀后移入预冷的电击杯底部，进行瞬时电击，促进质粒转入感受态细胞中；