[发明专利]一种原位荧光标记地杆菌的方法

权利要求书

1.一种原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：将PpFbFP荧光蛋白基因转入地杆菌（Geobacter），所述PpFbFP荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：所述地杆菌为Geobacter sulfurreducens菌。

3.根据权利要求2所述的原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1，采用质粒pUC19构建含有PpFbFP荧光蛋白基因的质粒pUC-PpFbFP；所述质粒pUC-PpFbFP的结构为质粒pUC19的位点GSU0808、庆大霉素抗性基因Gent、PompJ强启动子、PpFbFP荧光蛋白基因、质粒pUC19的位点GSU0807依次串联连接；

S2，将步骤S1构建的质粒pUC-PpFbFP转入Geobacter sulfurreducens菌。

4.根据权利要求3所述的原位荧光标记地杆菌的方法，其特征在于：步骤S2具体为：

A，使用限制性内切酶ScaI单酶切质粒pUC-PpFbFPFP使其线性化，并将线性化质粒进行浓缩；

B，在厌氧条件下，将培养至对数期的Geobacter sulfurreducens PCA 4 ℃预冷后，离心并收集菌体，并用4 ℃预冷的电转Buffer 洗涤菌体两次，制备Geobacter sulfurreducens PCA感受态；

C，取浓缩后的线性化质粒pUC-PpFbFP加入到Geobacter sulfurreducens PCA感受态细胞悬浮液中，混匀后移入预冷的电击杯底部，进行瞬时电击，促进质粒转入感受态细胞中；

D，用NBAF培养基悬浮转化后的Geobacter sulfurreducensPCA电感受态细胞进行培养，取不同浓度的菌液涂布含有庆大霉素的NBAF琼脂平板，并将其置于厌氧培养箱中培养，挑取平板上的单菌落接种到NBAF培养基中，待菌株增殖生长后进行PCR扩增验证。

5.一种质粒pUC-PpFbFP的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）提取Geobacter sulfurreducens PCA 基因组DNA，并以Geobacter sulfurreducens PCA 基因组DNA为模板，以引物对GSU0808F/GSU0808R、PompJF/PompJR、GSU0807F/GSU0807R，利用PCR扩增技术分别扩增GSU0808、PompJ及GSU0807的核苷酸序列；采用质粒pCM351、引物对GentFor/GentRev，利用PCR技术扩增庆大霉素抗性基因Gent；引物GSU0808F、GSU0808R、GSU0807F、GSU0807R、PompJF、PompJR、GentFor、GentRev的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：9所示；

（2）将扩增的GSU0808、PompJ、GSU0807核苷酸序列及基因Gent进行纯化；

（3）将纯化的GSU0808、PompJ、GSU0807核苷酸序列、基因PpFbFP及基因Gent与线性化的pUC19质粒载体进行Infusion构建质粒pUC-PpFbFP；所述质粒pUC-PpFbFP的结构为GSU0808、Gent、PompJ、PpFbFP、GSU0807依次串联连接；基因PpFbFP的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；

（4）将重组质粒pUC-PpFbFP 转入E. coli DH 5α感受态细胞进行培养，挑取单菌落并进行测序验证。

6.一种根据权利要求5所述的方法构建的质粒pUC-PpFbFP。