[发明专利]检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒、及其应用

说明书

本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒，所述试剂盒包含针对SEQ ID NO：1所示非洲猪瘟病毒MGF360‑13L基因序列或其部分序列设计的引物对和探针。本发明的检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，能快速、准确地对非洲猪瘟病毒(ASFV)进行检测，灵敏度高、特异性强、重复性好，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种基于MGF360-13L基因检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒、及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus,ASFV)感染引起的一种猪的急性、热性、高度接触性传染病。临床上主要以高热皮肤和内脏器官出血、共济失调和食欲废绝为主要特征，死亡率接近100％。非洲猪瘟是世界动物卫生组织(OIE)要求法定报告的动物疫病，我国动物病原微生物名录将其列为一类病。自2018年8月3日中国农村农业部在辽宁省确认非洲猪瘟疫情以来，非洲猪瘟已蔓延至32个省级行政区域，使得近120万头生猪遭到扑杀，对中国养猪业造成了巨大的经济损失，严重威胁畜牧业的健康发展，也给人类公共卫生造成了威胁。ASFV属于非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属，是该科的唯一成员。ASFV基因组大小170～190kb，是一种双股DNA病毒，编码160～175个基因。用编码VP72蛋白的B646L基因分析不同地区ASFV分离株，可以将ASFV流行株分为22个主要的基因型，其中流行于中国的主要是基因II型。

目前针对ASFV的检测技术主要分为两大类，即基于病毒抗体的免疫学检测方法和基于病毒核酸的PCR检测技术。针对ASFV的免疫学检测方法主要有红细胞吸附试验(HA)、直接荧光抗体试验(FAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。免疫学检测方法的优点在于可以准确反应病毒的发生和发展情况。但是，免疫学检测方法试验要求高、费用高、耗时长、敏感性较低。此外，ASFV感染早期并不会产生抗体，因此免疫学检测方法的使用受到了局限。近年来，荧光定量PCR由于敏感性高、特异性好、耗时短及定量准确等优点而逐渐被广泛应用。荧光定量PCR主要包括SYBR Green I法和TaqMan探针法，TaqMan探针法相对于SYBR Green I法具有更高的特异性，应用价值更高。

ASFV基因组庞大，其基因组中约30％的开放阅读框存在多个拷贝，即多基因家族(Multigene families,MGFs)，包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505(在Malawi分离株中命名为530)。MGF编码的多个拷贝提示病毒的选择进化可能与此相关。虽然对MGFs的功能尚待深入研究，但研究已证明MGF在病毒的感染过程中有重要作用。敲除ASFV强毒或弱毒株MGF360和530/505的某些基因将导致病毒在巨噬细胞或软蜱体内的复制效率下降，免疫动物后可以提供针对同源病毒或部分异源病毒的保护力；缺失MGF360的10L、11L、12L、13L、14L和MGF530/505-1R、-2R、-3R基因的弱毒株OURT88/3，在体内和体外均可激发较高水平的IFN(Interferon)表达，这种缺失毒株可以对某些基因型提供一定的攻毒保护能力；除此之外，同样缺失ASFV Benin 97/1毒株的上述基因，并使MGF360-9L与MGF 505-4R失活，以此缺失毒株感染猪巨噬细胞可检测到IFN-β的表达水平较原始毒株明显升高，而以这种缺失毒株免疫猪后可以提供一定的免疫保护，且这种保护还与病毒毒力成剂量相关。这些都说明MGF360家族有很大的研究价值，有必要建立针对MGF360家族的检测方法。

发明内容

本发明要解决目前缺乏快速、准确检测非洲猪瘟病毒试剂盒的技术问题，提供一种荧光定量RT-PCR检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、及试剂盒，该试剂盒能快速、准确、灵敏、特异地对非洲猪瘟病毒(ASFV)进行检测。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现: