[发明专利]一种构建测序文库的方法及试剂盒

说明书

本申请提供一种构建DNA文库的方法与构建DNA文库的试剂盒。所述方法与所述试剂盒透过将病毒RNA、反转录酶与特异性引物对混合以进行反转录PCR(RT‑PCR)与PCR，产生长度在450bp以下的DNA片段；及利用连接酶连接所述DNA片段、条形码(barcode)及接头，以简便、快速的产生DNA文库。所述方法与传统建库的流程相比，减少了片段截切、打断的步骤，节省时间而增加了效率。同时，跟融合引物的方法比较，又避免由于融合引物的长度过长造成的非特异扩增和低效率扩增等问题，具有更灵活可靠的优势。所述试剂盒，由于通过特异区域引物一步法的RT‑PCR与PCR直接扩增出需要测序区域，来简化实验步骤，而能有效改善应用于二代测序平台的DNA文库的建构。

技术领域

本申请涉及测序技术领域，尤其涉及一种二代测序平台的DNA文库的构建方法及试剂盒。

背景技术

1977年，英国生物化学家弗雷德里克·桑格发明双脱氧链终止法DNA测序法，又称桑格法(Sanger method)。双脱氧链终止法与化学降解法以及其衍生方法统称为第一代DNA测序技术，为人类基因组计划所使用主要测序方法。但由于其存在成本高、检测周期长、通量低等不足，已经逐渐被淘汰。

高通量测序技术(High-throughput Sequencing)是对传统Sanger测序革命性的改变，由于该种方法能够一次同时对几十万到几百万核酸分子进行序列测定，因此被称为二代或者下一代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)。高通量测序技术的特点是能实现多基因平行检测，比传统检测方法精确度和灵敏度更高，能更真实检测病毒或肿瘤变异全景。随着HiSeq X-10,MiSeq和Nextseq 500为代表的第二代测序技术的快速发展，越来越多的生物学问题通过二代测序技术得以解决。在用药指导方面的应用广泛，其中最重要的是病毒耐药性的指导和肿瘤个体化治疗基因检测等。相对于传统检测，NGS技术更能全面覆盖基因变异情况,为患者个体化用药提供更多参考。

在NGS平台中，Ion Torrent是第一个没有采用光学感应的NGS平台。Ion Torrent的原理是测序前先将提取的DNA打碎为一定长度的碎片，而后把单个碎片与一个布满探针的微型小球相连接。接着通过扩增技术，将这个微球的表面布满的探针扩增为有相同序列的DNA片段，这时微球就像一个毛球。此后，将微球放入含有上百万微孔的测序芯片上，通过每次放入含有一个碱基的液体，每轮分别重复4次以放入不同碱基(A\T\G\C)，就会发生至少一次的DNA合成。在合成过程中，dNTP会释放出氢离子，使pH值改变，通过微孔底部的感受器如互补金属氧化物半导体(complementary metal-oxide-semiconductor，CMOS)以及离子敏感场效应晶体管(ion-sensitive field-effect transistor，ISFET)，来检测在某一轮的某个碱基所出现的信号转化成电信号。最终，将电信号整合就能获得DNA的实际序列。

传统NGS平台中构建扩增子文库的方法步骤繁琐，需要经过多次PCR扩增、酶解消化、连接接头、反复多次纯化等步骤。传统NGS平台不但需要花费大量的时间和人员成本，并且由于多步骤操作中需要将样品反复暴露在空气中，文库易被污染。另外，增加文库操作步骤会导致其损失率高，并导致文库的复杂程度降低，会降低低丰度突变的检出率。此外，在传统的构建扩增子文库的方法中，单个样品建立文库的成本较高，严重影响到NGS技术的临床应用。

另外，通过融合引物的方法构建NGS的文库得到广泛运用。但是此方法需要预先合成测序接头以及barcode，不但增加引物的长度，同时可能会引起非特异扩增、扩增效率降低等缺点。

本申请旨在提供一种一步法的构建DNA文库的试剂盒，及透过操作此试剂盒来完成的DNA文库的构建方法。透过本申请的构建DNA文库试剂盒与方法，不但可以利用PCR扩增测序区域的优势，而且通过采用不同的接头和barcode直接跟PCR产物连接，增加了测序的灵活性，而能高效制备用于ion torrent二代测序平台的病毒DNA文库。

发明内容