[发明专利]基于固定化金属离子亲和色谱法富集实现血浆中D-二聚体定量的方法

说明书

本发明涉及一种基于固定化金属离子亲和色谱法(immobilized metal affinity chromatography，IMAC)富集实现对血浆中D‑二聚体质谱定量的方法。取D‑二聚体血浆样品，酶解得到血浆蛋白酶解液，使用IMAC富集酶解液中D‑二聚体蛋白特异性的交联肽段，最后使用液相色谱‑质谱联用仪进行鉴定和后续定量。由于D‑二聚体结构中特异性的交联肽段氨基酸序列中含有4个组氨酸，可以和金属离子形成强的配位相互作用，使用该方法可以有效地将其进行富集，从而降低D‑二聚体样品的复杂性，提高其在质谱检测中的灵敏度。该方法可以实现完全不依赖抗体对血浆中D‑二聚体检测定量，具有潜在的临床使用价值。

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向复杂生物样品生物标志物检测定量预处理方法技术领域，具体涉及将固定化金属离子亲和色谱富集方法用于血栓类疾病标志物D-二聚体的质谱检测和定量。

背景技术

作为血液凝结中交联纤维蛋白原水解的重要产物(文献1.Weisel,J.W.,Fibrinogen and fibrin.Advances in protein chemistry,2005.70:p.247-299.)，D-二聚体是不同血栓类疾病的重要疾病标志物，比如静脉血栓栓塞(venous thromboembolism)(包括深静脉血栓和肺栓塞)和弥散性血管内凝血(disseminated intravascularcoagulation)(文献2.Kyrle,P.A.and S.Eichinger,Deep vein thrombosis.Lancet,2005.365(9465):p.1163-1174.文献3.Goldhaber,S.Z.and H.Bounameaux,Pulmonaryembolism and deep vein thrombosis.Lancet,2012.379(9828):p.1835-1846.文献4.Voves,C.,W.A.Wuillemin,and S.Zeerleder,International Society on Thrombosisand Haemostasis score for overt disseminated intravascular coagulationpredicts organ dysfunction and fatality in sepsis patients.Blood CoagulationFibrinolysis,2006.17(6):p.445-451.)。在凝血级联过程中，首先凝血酶对纤维蛋白原的酶切会使其形成纤维蛋白，并迅速通过非共价相互作用整齐的排列在一起，然后通过XIIIa因子催化这些纤维蛋白的D区域就会通过赖氨酸和谷氨酰胺氨基酸残基形成的异肽键共价交联在一起，最后通过纤溶酶水解，产生一些列纤维蛋白原水解产物(fibrin degradationproducts,FDPs)，其中含有交联的D区域的被称为D-二聚体。作为交联的纤维蛋白的特异性产物，D-二聚体可以表明纤维蛋白的水解程度，因而可以作为不同血栓类疾病的疾病标志物，在临床疾病诊断中具有中要意义。

尽管D-二聚体是临床疾病诊断中一个重要的疾病标志物，但是目前仍然缺乏能够使D-二聚体定量标准化的方法。因为不同水解程度的纤维蛋白产生的D-二聚体具有内在的不均一性，目前常用的基于抗体的检测方法往往因为其识别的表位不同从而检测结果不一致，不同医院使用的不同的D-二聚体检测试剂盒往往具有不同的检测结果和诊断截断值，这使得发展一种不依赖于抗体的D-二聚体检测定量方法非常有必要，这将对促进D-二聚体方法标准化具有重要意义(文献5.Adam,S.S.,N.S.Key,and C.S.Greenberg,D-dimerantigen:current concepts and future prospects.Blood,2009.113(13):p.2878-87.文献6.Kahler,Z.P.and J.A.Kline,Standardizing the D-dimer Assay:Proposing the D-dimer International Managed Ratio.Clin Chem,2015.61(5):p.776-8.)。