[发明专利]基于固定化金属离子亲和色谱法富集实现血浆中D-二聚体定量的方法

权利要求书

1.基于固定化金属离子亲和色谱法富集实现血浆中D-二聚体定量的方法，其特征在于：

取D-二聚体血浆样品，酶解得到血浆蛋白酶解液，使用IMAC富集酶解液中D-二聚体蛋白特异性的交联肽段，最后使用液相色谱-质谱联用仪进行鉴定和后续定量；

该方法的步骤如下：

(1)取血浆样品，变性酶解；

(2)步骤(1)获得肽段溶液中添加稳定同位素标记的重标交联肽段,酶解所用的酶为胰蛋白酶, 使用溶液酶解或超滤辅助酶解的方式进行酶解，如果使用溶液酶解方法要求酶解物使用C18固相萃取柱除去酶解溶液中的小分子变性剂和缓冲液然后冻干之后复溶进行后续步骤，如果使用超滤辅助酶解要求后续酶解液浓缩到50 μL以下再进行后续步骤;

(3)让步骤（2）中的混合肽段溶液在上样缓冲液中和使用上样缓冲液平衡好的IMAC微球进行结合；

(4)使用上样缓冲液反复清洗步骤(3)中的IMAC微球，除去不含组氨酸和含一个或者两个组氨酸的肽段；

(5)使用洗脱缓冲液将步骤(4)中结合的肽段洗脱下来；

(6)除盐和后续质谱检测和定量。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

步骤(1)中的变性为蛋白质组学中的还原烷基化过程。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的稳定同位素标记的重标交联肽段和目标内源性D-二聚体特异性的交联肽段氨基酸序列完全相同，其中一个或二个以上的氨基酸中碳、氢、氧或氮元素中一种或者二种以上的元素被对应的稳定同位素形式取代。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)中使用的IMAC材料中的金属离子为和组氨酸中的咪唑基团相互作用的镍离子、铜离子、锌离子或者钴离子中的一种。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

步骤(3)和步骤(4)中的上样缓冲液根据选用的不同固定化金属离子适当加入低浓度的竞争洗脱剂，使得含少量组氨酸的肽段也被清洗下来，增加富集的特异性。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

步骤(5)中的洗脱通过添加高浓度的竞争洗脱剂或者调节pH值实现。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)的实现方式为在离心管中振荡离心，或将IMAC微球填充到固相萃取柱中，或者将IMAC微球填充到移液枪枪头中制成微柱等多种形式。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

步骤(6)中除盐的样品用0.1% v/v甲酸水复溶后用于LC-MS/MS检测，数据采集使用数据依赖检测模式和/或者靶向检测模式；所使用的靶向检测模式为多反应监测模式和平行反应监测模式，使用同位素内标法实现对血浆样品中的D-二聚体进行绝对定量。