[发明专利]一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用

说明书

本发明涉及一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用。该方法通过在样品预处理过程中使用与胰蛋白酶不同的多种限制性内切酶处理胶原蛋白的方式，从胶原蛋白中获得专属性肽段，用来鉴别不同物种来源的皮类、胶类中药及其产品的真伪，并判断未知胶类样品的种属来源。并且本发明从高保守的胶原蛋白中获得专属性肽段的方法有利于中药皮类、胶类动物药的质量控制，可大大提高皮类、胶类动物药产品及行业的检测效率和准确度，特别是阿胶类中药及其中成药的鉴别，具有重要的科学意义与应用价值。

技术领域

本发明属于医药与食品检测技术领域，具体涉及皮类、胶类中药专属性肽段的寻找与发现，可应用于皮类、胶类中药真伪鉴别，如阿胶及其制品真伪鉴别及判断其掺假物种。

背景技术

胶原蛋白(Collagen)是动物体内一类重要的蛋白质，约占动物总蛋白的30％，主要分布在皮肤、结缔组织、骨骼等部位，支撑着皮肤与各个组织器官形态、结构的完整性，有保护机体和支撑器官的重要作用。动物皮肤真皮层中富含大量的胶原蛋白。传统中药胶类药材如阿胶、黄明胶、鹿角胶等，是将动物的皮、角、骨或壳在高温高压条件下长时间熬制，使得胶原蛋白发生不同程度的水解并溶解，经过浓缩干燥后得到的药材，阿胶补血滋阴，润燥，止血；鹿角胶温补肝肾，益精养血；龟甲胶滋阴，养血，止血。胶类动物药多具滋阴补血的功效。

胶类动物药中以阿胶(Asini Corii Colla)尤为名贵，阿胶具补血滋阴，润燥，止血之功。用于血虚萎黄，眩晕心悸，肌痿无力，心烦不眠，虚风内动，肺燥咳嗽，劳嗽咯血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏。《本草纲目》载：“阿胶《本经》上品。弘景曰：‘出东阿，故名阿胶’”。道地阿胶表面平整，无油气孔，质硬而脆，断面光亮细腻，碎片对光照视呈棕色半透明状，李时珍赞其“黄透如琥珀色，光黑如瑿漆”。

然而，在现有市场上存在假阿胶、伪劣阿胶，并以次充好向市场销售，严重影响了广大人民群众的饮食和用药安全。目前不法企业常以马皮、牛皮、猪皮等掺杂制备阿胶来以次充好，导致阿胶造假事件屡禁不止的原因之一是缺少简单、可行、准确的鉴定技术支持，动物皮经过熬制后，很难鉴别出动物皮的来源。因此，寻找胶类动物药的专属性肽段以鉴别真伪非常必要。本发明利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法可发现专属性肽段，这对于胶类动物药真伪鉴别，解决中药行业问题具有重大意义。

发明内容

本发明目的在于基于多种蛋白质内切酶切割胶原蛋白的方法获得专属性肽段，通过该方法能有效的寻找发现不同种属样品的专属性肽段，以利于中药胶类动物药及其制品的真伪鉴别及掺假物种的判别。从而为中药胶类动物药质量标准的提升奠定基础，为保证中药胶类动物药及其制品的质量提供科学方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种利用除胰蛋白酶外的多种蛋白质内切酶切割胶原蛋白，以获得具有专属性特征的肽段的方法。

从蛋白质数据库中搜索下载驴、马、骡、牛、鹿、羊、猪、狗、猫、兔等的胶原蛋白全序列。通过同源蛋白的氨基酸序列比对，确定同源蛋白之间的差异氨基酸位点，进一步通过选择合适的一种或多种蛋白质限制性内切酶，以切割蛋白质获得专属性肽段。

本发明通过一种或多种蛋白质限制性内切酶对同源蛋白进行切割，所用的限制性内切酶包括：LysC、GluC、ArgC、LysN、AspN等。

本发明酶解反应条件为：胶原蛋白与每一种蛋白酶的摩尔比可从10000：1到1：1；酶解反应温度为10℃到45℃；酶解溶液的pH范围4.0到9.0；酶解反应时间为0.1小时到48小时。