[发明专利]一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂及其应用

权利要求书

1.一种犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂，其特征在于：所述复合制剂由犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体制备而成，其中所述噬菌体为噬菌体Phage-HY19，其保藏号为CGMCCNo.17584;

所述犬细小病毒卵黄抗体是采用灭活的犬细小病毒CPV-HuN1703株免疫蛋鸡，然后从鸡蛋蛋黄中提取纯化得到卵黄抗体，所述犬细小病毒CPV-HuN1703株微生物保藏编号为CGMCC No.17583;

所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备犬细小病毒卵黄抗体；（2）噬菌体悬液的培养；（3）药物制剂的制备;

所述药物制剂的制备的方法包括：步骤一，将卵黄抗体原液与噬菌体悬液按照1:1混合；步骤二，向步骤一制备得到的噬菌体悬液中加入其体积30%的多孔淀粉，室温下搅拌均匀，得到悬浮液；步骤三，将步骤二的悬浮液与等体积的质量浓度为3%的海藻酸钠溶液混合，充分混匀后，加入步骤二的悬浮液体积3%的质量浓度为5% 的CaCl₂ 溶液，充分混匀后经喷雾干燥设备脱水，制剂粒径分布在15-50μm，制备得到犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂。

2.根据权利要求1所述的犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）制备犬细小病毒卵黄抗体；（2）噬菌体悬液的培养；（3）药物制剂的制备；

所述制备犬细小病毒卵黄抗体的方法包括如下步骤：（1）制备犬细小病毒抗原；步骤a，按照常规方法培养猫肾传代细胞F81：生长液为含5%胎牛血清、含青霉素钠和硫酸链霉素各100μg/mL的MEM，在37℃，5%CO₂ 培养箱中培养传代，待细胞生长至80%汇合度时，用PBS 洗涤1 次后更换为无血清培养基；步骤b，取含量为5×10⁴TCID₅₀/ml 的犬细小病毒CPV-HuN1703 株按5%的体积百分比接种到步骤a 制备的长势良好的F81 细胞，37℃吸附1 小时，弃去吸附液，补加含有10 μg/mL胰蛋白酶的MEM 作为维持液继续培养；步骤c，接毒后，每日观察3 次，记录细胞病变情况，待细胞病变率达80%以上时进行收获，-80℃反复冻融三次，8000 rpm 离心15min，收集上清液，即为病毒液；步骤d，将步骤c 制备得到的病毒液经浓缩后，加入0.2%甲醛37℃灭活24 小时得到犬细小病毒CPV-HuN1703株疫苗原液；步骤e，将犬细小病毒CPV-HuN1703 株疫苗原液和佐剂按1:1的体积比在无菌环境中搅拌混合均匀，即制得所述犬细小病毒抗原；所述犬细小病毒抗原中含有犬细小病毒CPV-HuN1703株≥5.5×10⁵TCID₅₀/mL；其中所述佐剂为弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；（2）免疫蛋鸡：采用犬细小病毒抗原免疫接种20周龄产蛋母鸡，首次使用弗氏完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原，免疫剂量为1ml/只；首次免疫后2周、4周改为弗氏不完全佐剂乳化的犬细小病毒抗原进行第二次免疫和第三次免疫，免疫剂量分别为2ml/只、4ml/只；第三次免疫后第7天开始收集鸡蛋，测定鸡蛋卵黄液中犬细小病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:256以上的卵黄液，用于犬细小病毒特异抗体卵黄抗体的制备；（3）从免疫鸡蛋中制备抗体原液：将收集的免疫鸡蛋经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，先后加入2倍体积的0.01M，pH7.2 PBS 缓冲液和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和35%硫酸铵沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4℃透析24小时，经0.22μm滤膜过滤后，置于温度为54～60℃的环境中，保持8～20小时，进行病毒的灭活，获得抗体原液，即为纯化的卵黄抗体；

所述噬菌体悬液的培养方法为：噬菌体悬液的制备：将噬菌体Phage-HY19 按最佳MOI加入到培养至对数生长期的宿主菌E.coli-HuNHY19培养液中，所述宿主菌E.coli-HuNHY19为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），保藏号为CGMCC No.17622；再加入CaCl₂ 至终浓度1mM，37℃，150rpm 摇振培养12h，12000×g，4℃，离心10min，取上清，上清液经0.22μm 的无菌滤器过滤，而后加入MgSO₄ 溶液至终浓度2mM，调整滴度至4×10⁸pfu/mL，得到噬菌体悬液；

所述药物制剂的制备的方法包括：步骤一，将卵黄抗体原液与噬菌体悬液按照1:1混合；步骤二，向步骤一制备得到的噬菌体悬液中加入其体积30%的多孔淀粉，室温下搅拌均匀，得到悬浮液；步骤三，将步骤二的悬浮液与等体积的质量浓度为3%的海藻酸钠溶液混合，充分混匀后，加入步骤二的悬浮液体积3%的质量浓度为5%的CaCl₂ 溶液，充分混匀后经喷雾干燥设备脱水，制剂粒径分布在15-50μm，制备得到犬细小病毒卵黄抗体和噬菌体复合制剂。