[发明专利]一种基于RAA荧光法快速检测流感病毒H5N1的引物、探针及检测试剂盒

说明书

本发明提供一种基于RAA荧光法检测流感病毒H5N1的引物、探针及检测试剂盒，所述引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出流感病毒H5N1，特异性能够达到100％，所述检测试剂盒能够方便快速且准确地鉴定流感病毒H5N1，操作方便，检测时间短，15min内可以完成检测，无需像PCR一样通过高温95℃变性使DNA解旋，再在50～60℃退火，最后在72℃完成延伸，只需在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测。也无需像LAMP技术一样使用4‑6条引物在65℃情况下进行扩增且容易产生假阳性。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是涉及一种基于RAA荧光法快速检测流感病毒H5N1的引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

流行性感冒(流感)是一种由流行性感冒病毒引起的季节性急性上呼吸道感染疾病。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)不完全统计,平均每年全世界约有三百万到五百万人感染流感病毒,其中约有五十万人死于流感病毒。

流行性感冒病毒简称流感病毒,是一种RNA病毒,呈球形或丝状,直径80～120nm,分为A(甲)、B(乙)、C(丙)三型,这三型具有相似的生化和生物学特征。流感病毒有一层脂质囊膜，膜上有蛋白质,是由凝血素(H)和神经氨酸酶(N)组成,均具抗原性,易发生变异。A型流感病毒主要有H和N变异,H有16个亚型,N有9个亚型,因此A型流感病毒又分很多亚型。A型流感病毒是引起人畜流感的主要病毒,且经常发生抗原变异,传染性大,传播迅速,极易发生大范围流行。例如,2009年4月,美国和墨西哥爆发甲型H1N1流感,继而造成全球的大流行,威胁及干扰到全世界人民的健康及生活质量。B型流感病毒变异性较柔弱,不再分亚型,一般引起局部流行。C型流感病毒的抗原性比较稳定,通常不会引起严重的疾病,可以散发出现。临床上绝大多数病例是由A型或B型流感病毒引起的。C型流感病毒只引起轻度的上呼吸道疾病。

禽流感病毒属A型流感病毒引起的禽类感染疾病。禽流感病毒血清型众多，变异性极强，高致病性毒株发病率和致死率可高达100％，一些低致病力毒株在短期内可变异成高致病性毒株，给养禽业及相关行业带来了毁灭性打击，对动物卫生、食品安全、人类健康和国家经济安全构成严重威胁，因此防治禽流感具有重要的公共卫生意义，已成为世界各国人畜共患病监测的重点。

为有效减少禽流感的发生率，迫切需要建立快速、准确的检测流感病毒的方法,这对于流感患者的临床诊断和及时有效的治疗具有重大的意义,对全球的流感流行趋势起到预见性的作用。目前诊断呼吸道腺病毒的实验室检测方法主要包括病毒分离培养法检测、血清学诊断、血清抗体检测及分子生物学方法检测。

病毒分离培养是鉴定病毒的经典方法,包括传统病毒分离培养和快速病毒分离培养。传统的流感病毒分离培养主要包括流感病毒鸡胚接种和细胞培养。具体操作方法是采样之后接种鸡胚或犬肾细胞，培养数天后再通过观察血细胞吸附情况判断有无流感病毒的存在。若有流感病毒存在,可通过免疫荧光来鉴别流感病毒的分型。传统流感病毒培养通常需要约2-14。

免疫荧光技术不仅可用于细胞培养中病毒的鉴定，也可用于临床标本中病毒抗原的检测，具有快速简便、特异性高的特点，但是其敏感性较低。

分子生物学方法如实时荧光PCR具有灵敏度，特性好，但需要专业技术人员和复杂的仪器和完备的实验室，时间周期也需要1.5-2小时；逆转录环介导等温扩增法(LAMP)具有等温60-65℃，具有很好的特异性，但假阳性率较高，引物设计复杂。

发明内容