[发明专利]斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针及试剂盒，涉及生物技术领域，其技术方案要点是：对斯里兰卡木薯花叶病毒中外壳蛋白基因的保守序列，设计出了特异性RPA引物、探针、试剂盒，能够对斯里兰卡木薯花叶病毒进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速，对进出口木薯种质及产品检验检疫具有科学指导意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针及试剂盒。

背景技术

斯里兰卡木薯花叶病毒(Cassava mosaic virus)是双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)成员之一。病毒粒子为双联体结构，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。病毒基因组由两个双链单链DNA组分组成，分别为DNA-A和DNA-B。DNA-A组分全长大小为2760bp，预计编码6个病毒蛋白，分别为外壳蛋白(Coat protein,CP)，运动蛋白(Movement protein,MP)，复制相关蛋白(Replication-associatedprotein,Rep)，转录激活蛋白(Transcriptional activator protein,TrAP)，复制增强子(Replication enhancer,REn)和与症状形成和细胞周期相关蛋白。DNA-B组分全长大小为2737bp，预计编码2个病毒蛋白，分别为运动蛋白(MP)和核穿梭蛋白(Nuclear shuttleprotein,NSP)。

木薯是世界上列于谷类和豆类之后的重要粮食作物，主要种植于在非洲、南美洲、东南亚和印度等，其中非洲是最大的木薯产地。斯里兰卡木薯花叶病毒是木薯最重要的病毒之一，在斯里兰卡、印度等亚洲地区引起危害，严重地区危害达100％。目前，该病毒病未在我国木薯上大面积发生。但是，我国从非洲、印度等疫区引进木薯种质，存在传入我国并大面积危害的隐患。

目前，针对斯里兰卡木薯花叶病毒的检测方法主要有酶联免疫吸附法和PCR法等，其中PCR应用较为广泛。酶联免疫法的灵敏、准确较低，容易出现假阳性和假阴性问题；PCR灵敏、准确，但需要多种精密仪器配合使用。因此，基于不依赖PCR仪的等温扩增技术在田间检测就显得非常有应用价值。其中，RPA(Recombinase polymerase amplification)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。该方法主要具备以下优点：(1)仅需1对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程；(2)只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；(3)反应时间仅需40min；(4)结果易于判断，不像LAMP产物的弥散带，RPA扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带；(5)RPA与荧光定量PCR技术(qPCR)相结合，通过在反应体系中加入特定类型的探针，可以达到实时荧光检测。

然而，目前尚未有关于斯里兰卡木薯花叶病毒的RPA检测技术的报道，因此，如何研究一种斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针及试剂盒是我们目前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针，所述RPA引物核苷酸序列为：

正向引物F：CCTCGAAGGTTCGTCGCCGTCTGAACTTCGAC；

反向引物R：CTGGACTCAAACGATTGAACCTTACATGGGCC；

所述探针的核苷酸序列为P：