[发明专利]一种基于冰冻切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法

说明书

本发明公开一种基于冰冻切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法，属于分子细胞遗传学领域。本方法包括：获取杨树根尖，用卡诺固定液固定后水洗，再用包埋剂将其包埋并冷冻后切片，将切片粘附到载玻片上，随后经过烤片、变性、杂交、抗体检测等FISH步骤，最后在激光共聚焦显微镜下观察并捕获3D图像。本发明提供的方法可以获得根尖完整的组织结构且FISH信号清晰，相比传统制片方法获得的2D FISH结果，本发明的方法可以在三维水平直观展示染色体在细胞中的真实空间占位，以及在三维水平准确定位靶序列在细胞中的空间分布，可应用于杨树的染色体空间占位、基因表达及Hi‑C测序结果的分析等领域，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及一种基于冰冻切片的杨树根尖 3D荧光原位杂交（FISH）方法，可以用于杨树的分子细胞遗传学及表观遗传学研究。

背景技术

荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）是20世纪80年代发展起来的一项分子细胞遗传学技术，是将荧光素直接或间接标记的核酸探针与待测样本中的核酸序列按照碱基互补配对的原则进行杂交后在荧光显微镜下观察，根据荧光信号对待测样本中的DNA或RNA进行定性，定量或定位分析。过去的20年间，植物的FISH技术已取得了长足发展，尤其在探针种类方面，已从常用的rDNA等重复序列为主的探针发展到现在的寡核苷酸（Oligo）序列探针，FISH技术已广泛应用于不同种类植物的核型分析、基因定位、纠正基因组序列组装错误等多个植物分子细胞遗传学研究领域。

冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的方法。冰冻切片法所需制片时间短，一般材料的包埋和切片仅需10-20min，同时还可以保存组织内易被有机溶剂或高温破坏的物质，如脂肪和酶。因而冰冻切片广泛应用于临床病理组织和细胞化学研究。

伴随着植物基因组学、表观组学的迅猛发展，迫切需要从3D水平去认识染色体的结构及空间占位。然而，植物的FISH技术目前大多还停留在2D水平，不能分辨细胞内染色体的真实空间占位。这主要是因为植物FISH的制片方法主要是涂片，压片及滴片等，这些方法多是为了让中期染色体暴露出来，平铺在载玻片上，以便于显微观察及探针与靶序列的杂交复性，但这些制片方法改变了染色体在细胞中的原有空间位置，因而不能在三维水平上直观展示染色体的真实空间占位。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种基于冰冻切片的杨树根尖 3D荧光原位杂交方法，使用该方法在激光共聚焦显微镜下捕获的3D图像，可以在三维水平上直观展示染色体在细胞中的真实空间占位，以及准确定位靶序列在细胞中的空间分布。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于冰冻切片的杨树根尖3D荧光原位杂交方法，包括如下步骤：

（1）截取杨树幼嫩根尖浸入固定液固定1h以上，再用纯水洗2次，每次10 min，所述固定液为无水乙醇：冰乙酸=3：1的卡诺固定液；

（2）截取步骤（1）处理过的根尖顶端2-3mm的部分，用滤纸吸去表面多余水分，再用包埋剂包埋并冷冻后切片，将切片吸附到载玻片上，得到制片；将制片放入37℃培养箱过夜，然后用42℃纯水洗制片2min，以洗去包埋剂，再放到37℃培养箱2h，使切片彻底干燥并紧密粘附在载玻片上。

（3）将步骤（2）所得制片进行变性及杂交；

（4）将步骤（3）所得制片进行抗体检测。

进一步地，步骤（3）具体包括如下步骤：

1）将制片加100 μL 70% DFA，放置在85℃变性5min；

2）将制片立即用70%，90%，100%的冰乙醇逐级脱水，每级3min；

3）晾干备用；