[发明专利]一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法

说明书

本发明运用高效液相色谱仪建立了灵芝孢子粉及其产品中主要三萜类成分的分析测定方法。涉及样品前处理条件的优化、色谱柱的选择和色谱条件的优化，同时对建立的方法进行了方法学验证。本发明建立的灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，排除了脂肪酸、甾醇等弱极性脂溶性成分的干扰，突破了分光光度法用于测定孢子粉及其产品中三萜类成分的局限性，方法准确度高、特异性强。

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体是建立一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法。

背景技术

灵芝是担子菌门、伞菌纲多孔菌科灵芝属真菌，具有极高的药用价值，灵芝的化学成分复杂，包括多糖、三萜、甾醇、生物碱、氨基酸、脂肪酸等。其中灵芝三萜具有抗肿瘤﹑抗HIV-1型病毒﹑护肝﹑解毒和改善记忆力等多种功效，是衡量灵芝产品品质高低的重要指标之一。灵芝孢子粉是子实体发育成熟期从灵芝菌褶中弹射出来的生殖细胞，含有脂肪酸类、三萜酸类、多糖类等多种化学成分。

近年来，随着孢子粉收集和破壁技术的发展，灵芝孢子粉的药理作用已经受到消费者的广泛认可，但其中的标志性有效成分尚不明确，且缺乏法定的标准，孢子粉及相关产品常用灵芝子实体中的活性成分三萜或多糖作为质控指标，运用分光光度计法进行测定。但是孢子粉和孢子油中含有大量的油酸、亚油酸、麦角甾醇等弱极性脂溶性成分，都可以与香草醛高氯酸发生颜色反应，使三萜测定结果远远高于真实值。文献报道，运用分光光度法测得破壁孢子粉三萜含量为2.94％–3.43％，孢子油三萜含量高于20％。运用高效液相色谱法研究发现，市售灵芝孢子粉中灵芝酸类成分含量非常低，有些甚至检测不出。两种主流检测方法测定结果的差异，使得灵芝孢子粉中是否含有三萜和三萜的具体含量备受争议。

本发明在已有研究的基础上，排除脂肪酸、甾醇等弱极性脂溶性成分的干扰，对灵芝孢子粉的前处理方法和分析条件进行优化，建立了适合灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分分析测定的HPLC方法，方法不仅提高了结果的准确度和可靠性，而且减少了色谱柱的损耗和检测器的污染，为评价灵芝孢子粉及其产品的质量提供科学依据。

发明内容

本发明的目的是排除脂肪酸、甾醇等弱极性脂溶性成分的干扰，突破分光光度法用于测定孢子粉及其产品中三萜类成分的结果虚高的局限性，提供一种准确度高、特异性强、适用范围广的灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的检测方法。

本发明涉及一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，包括如下步骤：以40％乙醇水溶液为提取溶剂，提取液经50倍浓缩后，采用高效液相色谱法对灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的含量进行测定。

本发明一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，具体操作过程包括以下步骤：

(1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，将灵芝孢子粉或相关产品加入溶剂浸提，得到浸提液，离心，上清液经真空干燥后用乙醇复溶，经过滤后得到待测样品溶液；

(2)高效液相色谱检测步骤，对待测样品溶液进行高效液相色谱分析；

(3)指标成分是三萜类成分：灵芝酸I、灵芝烯酸C、灵芝酸C2、灵芝酸C6、灵芝酸G、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝烯酸E、赤芝酸A、灵芝烯酸D、灵芝酸D、灵芝酸F；

具体地，本发明所述灵芝孢子粉及其产品，包括未破壁孢子粉、破壁孢子粉及灵芝孢子油产品。

更具体地，本发明涉及灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，浸提方法包括以下步骤：所用浸提溶剂为正己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一种或为其不同浓度水溶液；提取方法为超声提取、加热震荡提取，优选超声提取；提取时间为10-90min，优选30min；料液比为1：10-1：50，其中孢子粉样品优选1：10，孢子油样品优选1：30；浸提次数包括一次浸提或反复浸提。