[发明专利]一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法

权利要求书

1.一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，其特征在于，包括如下步骤：以40％乙醇水溶液为提取溶剂，多倍浓缩后，采用高效液相色谱法对灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的含量进行测定。

2.根据权利要求1的一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，其特征在于，具体操作过程包括以下步骤：

(1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，将灵芝孢子粉或相关产品加入溶剂浸提，得到浸提液，离心，上清液经真空干燥后用乙醇复溶，经过滤后得到待测样品溶液；

(2)高效液相色谱检测步骤，对待测样品溶液进行高效液相色谱分析；

(3)指标成分是三萜类成分：灵芝酸I、灵芝烯酸C、灵芝酸C2、灵芝酸C6、灵芝酸G、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝烯酸E、赤芝酸A、灵芝烯酸D、灵芝酸D、灵芝酸F。

3.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所述灵芝孢子粉及其产品，包括未破壁孢子粉、破壁孢子粉及灵芝孢子油产品。

4.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，浸提方法包括以下步骤：所用浸提溶剂为正己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一种或为其不同浓度水溶液；提取方法为超声提取、加热震荡提取，优选超声提取；提取时间为10-90min，优选30min；料液比为1：10-1：50，其中孢子粉样品优选1：10，孢子油样品优选1：30；浸提次数包括一次浸提或反复浸提。

5.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，浸提溶剂的使用包括以下步骤：所用浸提溶剂为正己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中的一种，优选乙醇；继续优化浸提溶剂，所用浸提溶剂为不同浓度乙醇水溶液，醇溶液的浓度为20％-50％，优选40％的乙醇水溶液进行提取。

6.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(1)灵芝孢子粉及其产品的预处理步骤，浸提液的处理包括以下步骤：浸提液先经4 000r/min离心15min，取上清液，在50℃进行真空浓缩干燥，浓缩物按10倍-100倍浓缩比用乙醇复溶，优选50倍，溶液用0.22μm微孔有机相滤膜过滤，备用。

7.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(2)高效液相色谱法包括以下步骤：

色谱柱为反相C18色谱柱，流动相溶液成分为乙腈-水梯度洗脱，其中水中冰醋酸的浓度为0.00％-0.02％，优选0.01％；柱温为20-40℃，优选30℃；流速0.8-1.2ml/min，优选1.0ml/min；检测波长为250-260nm，优选252nm；进样体积为5-50μL，优选10μL。

8.根据权利要求7的一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，其特征在于：所用色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱、WatersCORTECS-C18(150mm×4.6mm，2.7μm)色谱柱或Omni Bond Hubble-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱。

9.根据权利要求7的一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，其特征在于：流动相的洗脱程序为：流动相(A)乙腈+(B)0.01％醋酸水(v/v)＝100％(体积)，0-5min，22％(A)；5-10min,22-35％(A)；10-30min,35-40％(A)；30-32min，40-42％(A)；32-37min，42-45％(A)；37-45min，45-65％(A)；45-55min，65-100％(A)；55-60min，100％(A)。

10.根据权利要求1-2的一种灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分的HPLC测定方法，其特征在于，所述步骤(2)-(3)高效液相色谱法还包括以下具体步骤：

1)系列标准品溶液的配制：用甲醇配制含有所述13种三萜化合物各适量的三萜混合标准品溶液，并依次用甲醇稀释成系列浓度梯度，备用；

2)各三萜组分的定性：将各三萜单组份及混合标准品溶液进行HPLC分析，根据各单组分的保留时间及紫外光谱定性；

3)标准曲线的绘制：取步骤1)中的系列标准品溶液，按照本发明所述色谱条件进行测定，以各组份溶液浓度(X，μg/mL)对色谱峰面积(Y)绘制标准曲线，得回归方程；或；

通过HPLC方法和分光光度法两种方法对灵芝孢子粉及其产品中三萜类成分进行了测定，比较了两种方法下结果的差异。进一步验证了分光光度法会使孢子粉和孢子油中三萜的测定结果严重偏高，呈现假阳性，通过HPLC法测定灵芝孢子粉及其相关产品中三萜类成分的含量更加客观准确。