[发明专利]一种基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用

说明书

本发明提供了一种基于适配体识别‑HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，检测方法包括：（1）制备DNA功能化纳米金探针；（2）制备适配体修饰磁性纳米颗粒；（3）合成用于杂交链式反应体系的发夹探针；（4）制备HCR反应产物；（5）检测靶标。本发明具有恒温扩增、灵敏度高、成本低等优点，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法及其应用。

背景技术

随金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. au）在自然界中普遍存在，是引起食源性疾病的主要病原菌之一，常污染乳和乳制品、肉和肉制品、禽蛋类制品、沙拉、糕点等食品。金黄色葡萄球菌在20~37℃之间繁殖4~8 h即可分泌肠毒素（Staphylococcalenterotoxins, SEs），是引起金黄色葡萄球菌食物中毒的主要致病因子。据统计，在世界由金葡菌肠毒素引起的食物中毒的事件在细菌性食物中毒的总事件中约占25%~45%。

目前，针对食源性致病菌的鉴定和检测方法主要基于三个原理：1）微生物培养法；2）特异性DNA杂交；3）基于抗原-抗体识别技术。其中，传统的微生物培养法耗时长、效率低，不能及时检出食品中的病原菌，无法满足快速检测需求。基于特异性DNA杂交的PCR技术和核酸探针技术具有较高的灵敏度，但对工作人员和检测设备的要求较高。虽然免疫分析技术在以上方面得到了很大改观，但抗体的制备需要免疫动物、成本高、抗体易失活。因此，迫切需要发展高灵敏、成本低、实用性强的食源性致病菌快速检测技术。

近些年，核酸适配体（Aptamer）作为新型识别分子逐渐成为研究热点，其本质是一段单链寡核苷酸折叠成发夹、茎环、假结体及G-四链体等二级或三级结构，通过氢键、范德华力等与靶分子相互作用而形成稳定的复合物，其空间结构的多样性几乎可以与所有种类的靶分子（细胞因子、蛋白、生物毒素、金属离子、小分子物质、细胞、微生物等）发生结合。与传统的抗体相比，具有适应范围广；高亲和力和高特异性，不受免疫条件和免疫原性限制；制备简单，可体外人工合成；变性与复性可逆，性质稳定；易于标记和保存等优点。

杂交链式反应（Hybridization chain reaction, HCR）是一种没有酶参与的体外核酸等温信号放大技术。由于HCR反应具有不需要酶参与、反应易控制、成本低，常温下即可进行反应，不需要大型仪器和专业人员，输出信号多样化等优点，使其在分析检测领域得到广泛应用。

发明内容

要解决的技术问题：针对现有技术的不足，本发明提出了基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，实现食品中食源性致病菌的高灵敏、低成本、简单、快速检测。

技术方案：一种基于适配体识别-HCR反应的金黄色葡萄球菌比色传感检测方法，包括以下步骤：

（1）制备DNA 功能化纳米金探针：

将巯基修饰金黄色葡萄球菌适配体2（SH-apt 2）和引发链（SH-Trigger probe）修饰在纳米金（AuNPs）表面，得到DNA修饰的纳米金探针（Apt2-AuNPs-TP），其中引发链包含与发夹探针H1的部分序列互补的d序列；

（2）制备适配体修饰磁性纳米颗粒：

通过戊二醛法将氨基化的Fe₃O₄磁纳米颗粒与链霉亲和素（SA）偶联，通过生物素-亲和素系统，将生物素（Biotin）修饰的金黄色葡萄球菌适配体1（Bio-apt1）固定于SA修饰的磁性纳米颗粒（MB）表面，得到适配体功能化的磁性纳米颗粒（Apt1-MB）；

（3）合成用于杂交链式反应体系的发夹探针：