[发明专利]一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液

说明书

本发明提供了一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液，包括黑素细胞从表皮的分离培养及冻存方法。本发明采用分散酶消化，所获得的黑素细胞具有良好的增殖能力、优良的黑色素表达能力。黑素细胞冻存液主要包括黑素细胞完全培养基、胎牛血清、二甲基亚砜，采用梯度冻存方法。该方法可用于培养增殖能力、迁移能力和黑素合成能力强的表皮黑素细胞，可以使患者的黑素细胞在体外更好的生长及分化，可用于临床白癜风或色素减退患者治疗及其相关研究。

技术领域

本发明涉及细胞体外培养技术，具体是一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法黑素细胞的冻存液。

背景技术

传统的白癜风治疗手段包括药物治疗、紫外线照射、外科手术治疗，目前自体黑素细胞移植成为白癜风治疗的研究和发展方向之一，但需要短时间内在体外大量扩增提高纯度的黑素细胞。为此，很多适合黑素细胞生长的培养基和纯化方法被报道，包括使用高浓度的胎牛血清培养基促进细胞生长。

冷冻保存在细胞的短期和长期保存中起着重要作用，对组织和细胞建库具有十分重要的意义。利用库存组织的基于细胞的治疗也越来越多地被用于再生医学的其他领域，借助冷冻保存技术，种子细胞可通过细胞库而及时提供，对临床研究及应用意义重大。冷冻保存降低了研发周期及成本，使得需要的种子细胞在严密监控的条件下进行生产和保存，且复苏后不影响其性能。

通常在冻存后由于冻存液的配方及冻存方法不合适，黑素细胞的活性及增值能力大大降低，严重影响其色素修复效果。细胞冻存除了报道添加冷冻剂外，也有文献增加细胞载体，一方面要考虑细胞载体厚度超过150um，有足够的机械稳定性使得在解冻后可控地将构建体转移进入机体中。另一方面要求细胞在合成的细胞载体中不发生整合，或仅在有限的程度上可能发生。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法。为实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于黑素细胞的分离培养包括以下步骤：

1).用PBS清洗表皮组织，医用酒精浸泡，PBS中含有或不含有双抗；

2).酒精浸泡好的表皮组织转入装有PBS的培养皿中，清洗数次后剪去皮下组织；

3).将处理好的皮肤组织用PBS清洗后，用消化酶消化，将皮肤组织修剪成一定大小的组织块；

4).分离的表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶消化；

5).在步骤4)消化后的组织中加入培养基，吹打获得细胞悬液，过滤，PBS清洗，离心，黑素细胞培养基为黑素细胞基础培养基加生长因子；

6).适量黑素细胞培养基重悬细胞后，置于生化培养箱继续培养；

7).黑素细胞贴壁至50-80％融合时，用胰蛋白酶消化提纯黑素细胞；

8).适量黑素细胞培养基重悬黑素细胞后离心，PBS清洗后再次离心。

9).黑素细胞培养基重悬黑素细胞后接种到培养瓶中；

黑素细胞的冻存液配方中包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清；

黑素细胞的冻存包括以下步骤：

10).待黑素细胞贴壁生长至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化；

11).将收集的黑素细胞进行离心，PBS重悬清洗后再次离心收集黑素细胞；

12).将收集的黑素细胞用配制好的冻存液重悬后转移到冻存管中；

13).按照梯度冻存方法冻存黑素细胞。