[发明专利]一种基于临床应用的表皮黑素细胞分离培养及冻存方法和黑素细胞的冻存液

权利要求书

1.一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于黑素细胞的分离培养包括以下步骤：

1).用PBS清洗表皮组织，医用酒精浸泡，PBS中含有或不含有双抗；

2).酒精浸泡好的表皮组织转入装有PBS的培养皿中，清洗数次后剪去皮下组织；

3).将处理好的皮肤组织用PBS清洗后，用消化酶消化，将皮肤组织修剪成一定大小的组织块；

4).分离的表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶消化；

5).在步骤4)消化后的组织中加入培养基，吹打获得细胞悬液，过滤，PBS清洗，离心，黑素细胞培养基为黑素细胞基础培养基加生长因子；

6).适量黑素细胞培养基重悬细胞后，置于生化培养箱继续培养；

7).黑素细胞贴壁至50-80％融合时，用胰蛋白酶消化提纯黑素细胞；

8).适量黑素细胞培养基重悬黑素细胞后离心，PBS清洗后再次离心；

9).黑素细胞培养基重悬黑素细胞后接种到培养瓶中；

黑素细胞的冻存液配方中包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清；

黑素细胞的冻存包括以下步骤：

10).待黑素细胞贴壁生长至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化；

11).将收集的黑素细胞进行离心，PBS重悬清洗后再次离心收集黑素细胞；

12).将收集的黑素细胞用配制好的冻存液重悬后转移到冻存管中；

13).按照梯度冻存方法冻存黑素细胞。

2.如权利要求1所述的一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于步骤1)中，双抗含量优选0％-5％，酒精浸泡时间优选10-200s；步骤3)中，将皮肤组织修剪成宽为0.5-10mm的组织块，消化酶优选中性蛋白酶，消化条件优选4℃，消化时间优选8-18h；步骤4)中，消化条件优选37℃，消化时间优选40-60min；步骤5)中，优选100-200目不锈钢网筛进行过滤，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min；步骤6)中，培养条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度，每24-48h换液一次；步骤7)中，采用梯度消化法提纯黑素细胞，消化条件优选10-30℃，消化时间优选2-3min；步骤8)中，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min；步骤9)中，细胞接种密度优选1×10³-1×10⁵个/cm²；步骤10)中，消化条件优选10-30℃，消化时间优选2-3min；步骤10)中，离心条件优选1000-2000rmp，离心时间优选3-10min。

3.如权利要求1所述的一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于黑素细胞培养基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例优选0～92﹕7～10﹕0～93，最优选比例：0﹕8﹕92。

4.如权利要求1所述的一种黑素细胞的分离培养及冻存方法，其特征在于步骤13)中的梯度冻存方法优选4℃→-20℃→-80℃→液氮的方式，其中细胞在不同温度下的优选放置时间分别为20-40min、40-70min、10-20h、长期，梯度冻存的方式可使用程序降温的细胞冻存盒，也可以利用冰箱人工操作。

5.黑素细胞的冻存液，其特征在于包含二甲基亚砜(DMSO)，包含或不包含黑素细胞培养基，包含或不包含胎牛血清。

6.如权利要求5所述的黑素细胞的冻存液，其特征在于黑素细胞培养基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例优选0～92﹕7～10﹕0～93。

7.如权利要求6所述的黑素细胞的冻存液，其特征在于黑素细胞培养基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例最优选比例是0﹕8﹕92。