[发明专利]基于参考基因组注释文件的高通量测序技术动物tRFs数据分析方法

权利要求书

1.一种基于参考基因组注释文件的高通量测序技术动物tRFs数据分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)文件准备步骤：

准备config文件，读取后用于进行数据自动化质控以及后续数据分析；

(2)tRNA数据库整理步骤：

利用NCBI或者Ensembl数据库中物种现有的参考基因组序列文件、参考基因组gff注释文件获得物种的tRNA序列信息包括转运的氨基酸，长度，反向密码子以及碱基信息；

(3)GO、KEGG背景文件整理步骤：

使用所述参考基因组序列文件、所述参考基因组gff注释文件提取物种的mRNA序列；根据所述mRNA序列文件、KEGG数据库、SwissProt数据库，整理GO、KEGG背景文件，包括mRNA注释文件，GO富集背景文件，KEGG富集背景文件，KEGG注释文件，KEGG pathway文件；

(4)下机数据质控步骤：

将下机得到的原始数据去除接头，保留15-41nt长度的序列，然后过滤低质量序列，即以5个碱基长度为窗口对原始序列进行搜索，当窗口中碱基的平均测序质量低于20时，将从窗口最前端开始的部分截断并舍弃；将过滤后的数据进行去重，获得无重复的序列，并标记所有序列的数量；同时对原始数据和过滤数据量进行统计，并以柱状图展示各个样本不同长度序列的数量分布特征；过滤序列用于后续分析；

同时根据参考基因组gff注释文件和参考基因组序列获得tRNA序列，接着将所有样本高质量序列数据合并去重后与整理好的tRNA序列进行0碱基错配比对，reads能从tRNA序列的5’或者3’端开始完全匹配且长度在15-30范围内的认定为潜在的tRFs，对于比对上同一tRNA的同一位置，即5’或3’端的reads，选取丰度最高的reads作为鉴定到的tRFs，根据获得的tRFs整理tRFs数据库；

(5)参考基因组比对步骤：

将上述去重后的序列与参考基因组序列做比对，筛选出碱基错配数小于2的结果，获得参考基因组的比对率；

(6)tRFs比对注释步骤：

将所述过滤后的数据合并去重之后与所述tRNA序列做比对，通过比对位置筛选出碱基错配数为0的结果，获得各样本的tRFs的鉴定注释结果，同时计算tRFs的表达量，并进行表达模式聚类分析；

(7)差异tRFs分析步骤：

根据所述注释到的tRFs信息以及表达量结果，使用DESeq或DESeq2进行差异表达分析，筛选同时满足差异倍数和显著性的差异表达tRFs，统计并展示可视化结果；

(8)靶基因预测、富集分析步骤：

将所述差异tRFs与所述物种mRNA序列进行靶标预测，统计靶标结合位点信息，绘制结合位点示意图；

对上一步预测到的差异tRFs靶基因，利用上述整理好的GO、KEGG背景文件使用超几何分布检验计算方法进行GO功能和KEGG通路的富集分析，计算GO、KEGG条目在差异tRFs靶基因中是否显著富集的P值，再对P值经BenjaminiHochberg多重检验纠正后得到FDR；针对富集结果做柱状图和气泡图统计，获得差异tRFs可能参与的功能和代谢通路；

(9)网页版报告整理步骤：

根据结果一键化生成tRFs分析的网页版报告，网页版报告对整个分析结果做汇总，并对每个分析步骤做描述和对应的图表展示以及弹窗式帮助文档，网页报告设置内部快捷链接和分析方法介绍/外部网站的链接，实现网页版内部快速跳转以及快速查阅网上资料。

2.如权利要求1所述的基于参考基因组注释文件的高通量测序技术动物tRFs数据分析方法，其特征在于，所述文件准备步骤当中config文件中包括：下机数据位置以及对应的样本分析名和分组名、用于差异分析的分组信息、差异倍数参数，生物学重复参数，参考基因组信息。

3.如权利要求1所述的基于参考基因组注释文件的高通量测序技术动物tRFs数据分析方法，其特征在于，所述tRFs比对注释步骤当中tRFs的命名方式为“tRNA-转运氨基酸简称-反向密码子-tRNA长度-5’或3’端”名称的命名方式。