[发明专利]一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法

权利要求书

1.一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，包括下述步骤：

1）建立伊蚊基因数据库：通过BOLDSYSTEMSDNA条形码数据库和NCBI DNA数据库，获得伊蚊基因序列；

2）建立伊蚊DNA二维码：通过Sequencher5.3软件聚类分析伊蚊基因序列，选取种类特异性的单核苷酸多态性SNP为靶标，建立伊蚊DNA二维码分形图；

3）多重PCR-MS引物设计：基于伊蚊DNA二维码分形图，使用MassARRAY AssayDesigner4.0软件，设计多重PCR特异性引物和探针；所述多重PCR特异性引物和探针如SEQID NO.1~SEQ ID NO.54所示；

4）多重PCR-MS质谱扫描：提取待测伊蚊的基因组，并依次进行前PCR反应、SAP酶处理、单碱基延伸和质谱分析，得出待检测伊蚊的具体种类。

2.根据权利要求1所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，步骤4）中，以Complete PCR Reagent试剂盒进行前PCR扩增，PCR扩增的体系为：

试剂 体积

H₂O HPLC grade 1.3µL

10×PCR Buffer含20mMMgCl₂ 0.5µL

25mM MgCl₂ 0.4µL

25mM dNTP mix 0.1µL

1µM Primer mix 0.5µL

5U/µLhot star Taq polymerase 0.2µL

总体积 3.0µL；

反应程序为：

3.根据权利要求2所述的一种基于PCR-MS质谱扫描鉴别伊蚊种类的方法，其特征在于，步骤4）中，以Complete PCR Reagent试剂盒进行SAP酶消化，SAP酶处理的过程包括：

步骤一取出PCR反应产物，4000rpm离心l min；

步骤二取出SAP反应试剂，试剂融化后，涡漩振荡20秒后掌式离心机离心l min；

步骤三配制SAP反应MIX：

试剂 体积

H₂O 1.53µL

10×SAP Buffer 0.17µL

1.7U/µLSAP enzyme 0.30µL

总体积 2µL；

步骤四在384孔微量滴定板的每孔中加入2µL的SAP混合物，封口，混匀，并在4000rpm下离心1 min；

步骤五将离心后的滴定板在37℃ 40min；85℃ 5min下孵育，然后4℃保存。