[发明专利]聚合物纳米孔道的构筑及其对miRNA的检测

说明书

本发明涉及一种仿生智能聚合物纳米孔道的构筑方法及其用途。所述不对称聚合物纳米孔道由苯二甲酸乙二醇酯(PET)核孔膜用径迹刻蚀法制备，经过聚乙烯亚胺和醋酸锆的修饰而成(详见说明书)。经实验发现，所述不对称聚合物纳米孔道借助氧化石墨烯的选择性吸附作用，可以用来检测血清中的miR‑122，而其他miRNA分子均不会造成干扰。因此，该智能纳米孔道可以用来建立肝癌相关miRNAs的检测新方法。

技术领域

本发明属于分析化学的纳米孔传感技术领域，涉及一种基于仿生智能纳米孔道的miRNA检测方法的建立。

背景技术

生物细胞膜表面有许多纳米孔道，它们在细胞的信号传递、能量转换、电位调控和物质交换等生命活动中发挥着极为重要的作用。然而这些由膜蛋白构成的纳米通道只能嵌入到不稳定的脂质膜中，因此细胞膜上的纳米通道具有脱离生命体系不稳定的特征。科学家们为了探索生命的奥秘，模仿生物离子通道的响应性，构筑了一系列具有类似响应性功能的蛋白质纳米孔道和固态纳米孔道。相对于蛋白质纳米孔道，固态纳米孔道在化学、热学和力学稳定性上具有明显优势，并可由常规半导体加工技术制成，这样既可以实现纳米孔的大规模加工，又可以控制其孔径。此外，固态纳米孔作为生命分析研究的平台，具有原位、准确、快速、高灵敏和免标记分析等优点，还可以通过微纳技术与其它微型探测器相集成，构建更加灵敏的单分子检测系统，具有重要的基础研究价值和广阔的应用前景。

miRNA是一类在真核生物中发现的内源性非编码RNA，由20-25个核糖核苷酸组成。近年来，有大量研究证据表明miRNA在肝癌的进展中发挥着重要作用，并且直接参与了肝癌细胞的分化、凋亡、侵袭和远处转移的过程。这使得miRNA迅速地成为新的肝癌早期诊断的标志物。其中miR-122是肝脏特异性高表达的一种miRNA，占成年肝脏miRNA表达总量的70％左右。过去的研究显示，miR-122在人肝癌细胞中的表达浓度下调，因此miR-122的分析检测与肝癌的早期诊断有着密切的关系。

目前，常用的miRNAs检测方法包括Northern印迹杂交、微阵列杂交技术、实时RT-PCR技术等。虽然这些方法在miRNA的临床诊断研究中具有重要的参考作用，但是他们自身都存在一些不可避免的缺陷：比如Northern印迹方法耗时长，检测步骤复杂；微阵列技术灵敏度较低且特异性不好；RT-PCR需要昂贵的仪器、逆转录步骤和温度循环。

而结合纳米孔技术进行miRNA分析有以下几个优势：(1)纳米孔传感器本身具有很高的灵敏度和特异性。(2)纳米孔技术的分析速度快、样品量需求少，且不需要进行DNA标记和复杂的前处理。因此，将DNA信号扩增技术与纳米孔道相结合，只需要相对简单的信号扩增就可以满足miRNA临床分析的要求。这种miRNA仿生智能纳米孔道的构筑无疑将丰富miRNA的检测手段，为推动miRNA的检测新方法的建立做出贡献。因此，开发一种能够高灵敏检测miRNA的智能纳米孔道具有重要的意义。

发明内容

本发明涉及一种仿生智能聚合物纳米孔道的制备及应用。该聚合物纳米孔道是基于核孔膜表面通过不对称的径迹刻蚀法制备得到的。制得的纳米孔道其大端孔径为1.3μm，小端孔径为30nm(见附图1)。通过静电吸附作用将聚乙烯亚胺固定到PET纳米孔表面的。然后再把锆离子通过螯合作用固定到聚乙烯亚胺上。当体系中存在目标miRNA(miR-122)时，miR-122会和溶液中的DNA探针(H₁，H₂，H₃，H₄)发生链置换反应和链杂交扩增反应，形成大量DNA/RNA双链，从而不被氧化石墨烯所吸附。由于锆离子和DNA分子有很强的结合能力，DNA双链会被锆离子修饰的纳米孔所吸附，并且可以改变纳米孔表面的电荷。这样，我们就可以通过测离子整流信号来定量miR-122的浓度。由于纳米孔道本身具有极高的灵敏度，加上DNA扩增反应，该传感体系可以实现对生物样品中的miRNA的超灵敏检测。

附图说明

图1聚合物纳米孔的扫描电镜(SEM)表征。(A)大孔端(B)小孔端；