[发明专利]一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法及试剂包

说明书

本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种用于基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法。本发明还涉及一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法所用试剂。本发明所提供的方法对ABO基因全长序列包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子序列进行长片段PCR扩增、扩增产物文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析。本发明所提供的试剂和方法可作为一种全新的、独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了ABO精确分型的问题，发挥NGS技术对ABO基因分型高通量、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

技术领域

本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法。本发明还涉及一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定用试剂包。

背景技术

ABO血型系统是目前已知的39个红细胞血型系统中最具临床意义的血型系统，对ABO血型抗原系统进行准确分型和诊断可以明确个体血型基因型。

ABO血型系统基因定位于9号染色体，基因组全长19514b，(未计算5’UTR和3’UTR区域)，由7个外显子和6个内含子组成。目前ABO血型系统基因分型技术有PCR-SSP、PCR-SSO、PCR-SBT、实时荧光PCR技术、基因芯片等。上述方法中除PCR-SBT方法外，其他几种方法是基于已知的多态性位点进行设计，测定的碱基序列范围有限；尽管PCR-SBT方法克服了上述缺陷，但是该方法也仅仅是对编码区序列进行检测，加之操作过程繁琐，难以实现高通量检测。研究发现ABO亚型标本的突变点或其形成机制涉及的序列范围广，需覆盖ABO全长序列的范围才能鉴别出亚型，明确可能形成的机制，然而现有的分子诊断方法难以满足该类需求。因此，从血液安全的角度，迫切需要建立ABO血型系统基因全长序列测定的方法，实现对所有样本ABO血型的精准鉴定和科学研究。

新一代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)采用并行测序的理念，可以同时对多个样本多个目标区域进行高通量测序分析，可实现对基因全长序列的测定分析。建立一种基于NGS技术的ABO血型基因高通量检测方法，可以实现ABO全长序列测定，获取ABO基因全长多态性特征，对于提升ABO血型分型的准确性有重要意义。

发明内容

针对现有ABO基因分型技术的缺陷，本发明的第一个目的在于提供了一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，以覆盖ABO外显子和内含子全部序列，并对ABO基因全长序列进行测序分析，获得ABO基因全长序列的多态性特征，为解决ABO血型标本的鉴定提供一种全新的方法。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述方法对ABO基因全长序列包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子序列进行长片段PCR扩增、扩增产物文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析，并包括以下步骤：

(1)针对ABO基因序列的特异性，设计并合成长片段PCR扩增引物；

(2)制备人基因组DNA；

(3)分两组PCR反应扩增人基因组DNA中ABO基因包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子区域序列；

(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行磁珠法纯化；

(5)通过Qubit DNA双链定量测定试剂将步骤(4)得到的两组纯化产物进行准确定量分析，并将两组纯化产物进行等摩尔混合；

(6)将步骤(5)得到的等摩尔混合产物进行文库制备，包括扩增产物采用转座子酶法片段化、片段化产物磁珠法纯化、Index序列扩增和文库扩增后片段选择；