[发明专利]一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法

权利要求书

1.一种利用玉米芯水解液中木糖一步发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述的方法为构建表达木糖脱氢酶xylb和赖氨酸脱羧酶CadA的基因工程菌，将基因工程菌制得的种子液按5％的体积比的接种量接种至含有玉米芯水解液的发酵培养基中发酵生产1,5-戊二胺；

其中，所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：

(1)构建重组质粒pCDFduet-CadA和重组质粒pTRC99a-xylb；

(2)构建大肠杆菌；

其中，含有玉米芯水解液的发酵培养基中各组分的浓度为2g/L酵母粉，5g/L蛋白胨，10g/L硫酸铵，氯化钾0.5g/L，硫酸镁1.6g/L，硫酸亚铁32mg/L，硫酸锰32mg/L，硫酸铜77mg/L，硫酸锌86mg/L，维生素B₁60mg/L，烟酰胺10mg/L，生物素30μg/L，碳酸钙10g/L；溶剂为玉米芯水解液；

其中，所述的发酵为37℃下发酵32～40h，发酵至10h时，向发酵培养基中加入IPTG至终浓度为1mmol/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒pCDFduet-CadA的构建方法为将来源于大肠杆菌MG1655的赖氨酸脱羧酶的基因CadA，两端设计酶切位点NotIII和BglII，亚克隆到载体pCDFduet上，获得重组质粒pCDFduet-CadA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒pTRC99a-xylb的构建方法为将来源于Caulobacter crescentus的木糖脱氢酶的基因xylb，两端设计酶切位点SacI和SalI，亚克隆到载体pTRC99a上，得到重组质粒pTRC99a-xylb。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，重组大肠杆菌的构建方法为将重组质粒pCDFduet-CadA和pTRC99a-xylb通过氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主Ecoli.NT1003，得到表达木糖脱氢酶和赖氨酸脱羧酶的基因工程菌。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的玉米芯水解液的制备方法为将玉米芯与稀硫酸混合后高温灭菌，再加入Ca(OH)₂调节pH至7.0～7.5，第一次过滤，向第一滤液中加入活性炭，加热，第二次过滤，所得第二滤液即为玉米芯水解液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，稀硫酸的体积分数为0.5％～3％，玉米芯与稀硫酸的质量体积比为150～200g/L；所述的高温灭菌为110～130℃灭菌15～30min；活性炭与第一滤液的质量体积比为10～20g/L；所述的加热为40～60℃下加热20～40min。