[发明专利]由糖蛋白制备糖链的方法、试剂盒和装置

说明书

由糖蛋白制备糖链的方法、以及用于由糖蛋白制备糖链的试剂盒和装置，所述方法包括：(I)使包含羟胺化合物和碱性试剂的糖链游离溶液接触糖蛋白，使糖链自糖蛋白游离，得到包含糖链的含糖链样品的工序；(II)使含糖链样品接触纯化剂，使前述糖链吸附至纯化剂的工序，所述纯化剂包含具有内铵盐结构的化合物，且用于提纯长度为单糖以上的糖链；(III)使糖链自纯化剂溶出的工序。

技术领域

本发明涉及由糖蛋白制备糖链的方法、试剂盒和装置。

背景技术

构成生物体的蛋白质大多受到糖链修饰，以键合有糖链的糖蛋白的形式存在。蛋白质通过该糖链修饰来调节高阶结构形成、细胞间信号传导、分子识别等功能、以及体内动态等。已知该糖蛋白的糖链的结构和分布会干预蛋白质的功能表达，随着多种疾病的发病、加剧，糖链结构会发生变化，存在糖蛋白的糖链可用作疾病生物标记物的可能性。此外启示出：在生物药品中，糖链不仅影响该药品的活性，还对抗原性、动态造成影响。

因此，可期待糖蛋白的结构分析在伴有糖链结构变化的各种疾病的发病机理的阐明、疾病治疗和诊断技术的开发等生命科学、医疗、新药等各种技术领域中发挥重要的作用，糖链结构分析的重要性日益提高。

因此，寻求构建可迅速、简便且高精度地分析糖链结构的技术。糖链的分析一般通过高效液相色谱法(HPLC)、核磁共振法、毛细管电泳法(CE法)、质谱分析法或它们的组合来进行。然而，为了通过上述方法来分析糖链，首先，必须使糖链自糖蛋白游离，并仅提纯(回收)所游离的糖链。

糖蛋白根据糖链与蛋白质的键合方式而分成N键合型糖链和O键合型糖链，以往，糖链自糖蛋白的游离通过与各个糖链相符的方法来进行。

例如，为了使N键合型糖链游离，可使用PNGaseF、糖肽酶A等酶使糖链游离。然而，使用酶使糖链游离时，预先将蛋白质用二硫苏糖醇等还原试剂处理后，通过使用碘代乙酰胺等烷基化剂进行处理而使其改性，进而，用胰蛋白酶等蛋白酶将其分解成肽后，使其与糖链游离酶反应而使糖链游离，因此，还包括前处理在内需要长时间。进而，由于PNGaseF、糖肽酶A非常昂贵，且进行多检体的分析，因此产生相当大的成本负担。

此外，还有不使用酶地而通过肼分解法等的化学反应使糖链游离的方法。例如，根据肼分解法，使充分干燥的糖蛋白溶解于无水肼，并在100℃下进行10小时以上的加热处理，主要用作使N键合型糖链游离的方法。需要在反应后减压馏去无水肼，进而使用碳酸氢钠和乙酸酐来进行乙酰化。其是因键合于糖链的N乙酰基、N羟乙酰基也分解并转化成氨基，因而肼通过乙酰化来恢复原状的操作。然而，肼分解法需要完全的无水条件，反应体系内即便是少量只要混入水就会导致显著的收率降低。因此，需要预先将试样充分减压干燥后再反应。进而，反应时间为10小时以上，若反应后还包括肼的馏去、再乙酰化，则至全部工序结束为止至少需要2天以上。进而，肼也是具有致癌性的毒物，且还是易爆炸性的化合物，因此，其处理需要多加注意。此外，通过乙酰化，在原本键合有N羟乙酰基等其它酰基的情况下，也全部作为N乙酰基体进行分析，因此，还存在无法进行N羟乙酰基神经氨酸的分析的问题。尤其是，在生物医药、糖链疾病标记物中，作为一种唾液酸的N羟乙酰基神经氨酸的有无有时会成为问题。

针对O键合型糖链的游离，尚未发现具有实用性的酶，因此，专门利用基于化学反应的游离。作为用于发生游离的化学反应，广泛使用在强碱水溶液中使糖链发生β脱离的方法。然而，游离出的糖链在碱的存在下立即被分解，因此，通常使用通过在硼氢化钠的共存下进行反应而将游离出的糖链立即还原成醛糖醇的方法。

由于用于赋予荧光标记的糖链侧的官能团即醛基被还原而变为醇，因此，游离出的醛糖醇无法赋予荧光标记。因此，一般将醛糖醇的全部羟基进行甲基化(完全甲基化)后，再利用质谱分析仪进行分析。

作为在保留醛基的状态下使O键合型糖链化学游离的其它方法，已知前述的肼分解法。在反应后，进行肼的馏去、再乙酰化，赋予荧光标记后，使用HPLC等进行分析。