[发明专利]用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症3型(PFIC3)的密码子优化的转基因

说明书

本公开涉及用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症3型的基因治疗载体。更具体地，本发明涉及腺相关病毒载体，其包含编码用于治疗PFIC3的MDR3亚型A的密码子优化序列。

技术领域

本公开涉及用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积症3型的基因治疗载体。更具体地，本发明涉及腺相关病毒载体，其包含编码用于治疗PFIC3的MDR3亚型A的密码子优化序列。

背景技术

进行性家族性肝内胆汁淤积症3型(PFIC3)是一种与三磷酸腺苷结合盒，亚家族B，4(ABCB4)基因突变相关的遗传疾病，该基因编码多药抗性蛋白3(MDR3)(Jacquemin E.ClinRes Hepatol Gastroenterol.2012；36 Suppl 1:S26-35)。该蛋白主要在肝细胞的小管膜中表达，是一种磷脂酶，参与磷脂酰胆碱从肝细胞膜向胆汁的转运。磷脂酰胆碱是通过产生混合胶束来中和胆盐的毒性所需的。ABCB4基因中的突变阻止适当的胶束形成，引起胆小管和胆道上皮损伤，从而导致胆汁淤积(Jacquemin E.et al.Gastroenterology.2001；120:1448-1458)。

目前尚无治愈PFIC3的方法，因此未满足的医疗需求非常高。尽管熊去氧胆酸(UDCA)疗法可能会改善某些患者的症状，但除肝移植以外，目前尚无治愈PFIC3的方法。胆道改道形式的手术干预改善患者的预后。但是，诸如感染和造口袋问题的术后并发症影响患者的生活质量，而肝硬化和肝癌的风险仍然存在。肝移植是一种有效治疗，但伴随着该复杂过程带来的风险以及病情复发的可能(van der Woerd WL et al.World Jgastroenterol.2017；23(5):763-775)。

纠正导致疾病发展的缺陷基因的基因疗法是用于多种疾病的有前景的治疗疗法。但是，该技术仍在研究中。WO2015/139093中公开了ABCB4在肝细胞中稳定整合和表达以治疗或预防PFIC3。但是，这些整合载体系统存在的主要缺点是其潜在的引起插入诱变的风险。仅WO2017/100551中提出了使用包括ABCB4在内的各种潜在治疗基因来治疗肝脏疾病(诸如进行性家族性肝内胆汁淤积症3(PFIC3))的RNA疗法。因此，仍然需要开发避免插入诱变并同时允许稳定且长期的转基因表达的基因治疗方法。本文描述了使用编码MDR3亚型A的密码子优化序列的PFIC3基因疗法，其可在胆汁淤积性肝中成功高表达，从而逆转引起患病患者胆汁中毒性的原因。

发明简述

令人惊讶地，发明人发现与野生型MDR3亚型A相反，当在体内施用时，MDR3亚型A的密码子优化序列显示了在肝细胞的小管膜中的特异性有效表达。在重现大多数PFIC3症状的Abcb4^-/-敲除小鼠中，施用编码密码子优化版本的MDR3亚型A的AAV达到长期治疗效果，诸如PFIC3血清生物标志物水平的显著恢复，肝脏和脾脏大小的减少，胆汁磷脂酰胆碱的增加以及肝脏形态异常的纠正。

因此，本公开的第一方面涉及核酸构建体，其包含编码MDR3亚型A的转基因，所述转基因由序列SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的序列表示。

在特定实施方案中，所述核酸构建体进一步包含在引入宿主细胞后启动转基因表达的启动子，优选肝特异性启动子，更优选α-1-抗胰蛋白酶启动子或胆盐诱导型启动子。在特定实施方案中，所述载体还包含聚腺苷酸化信号序列，例如具有序列SEQ ID NO:3的合成聚腺苷酸化信号序列。

在特定实施方案中，所述核酸构建体进一步包含5’ITR和3’ITR序列，优选腺相关病毒(AAV)的5’ITR和3’ITR序列，特别是来自AAV2血清型的5’ITR和3’ITR序列。

在更特定的实施方案中，所述核酸构建体包含核酸序列SEQ ID NO:4或与SEQ IDNO:4具有至少90％同一性的核酸序列，或由其组成。