[发明专利]用于WNT六肽的溶液相路径

说明书

本公开总体上涉及多肽合成领域，并且更具体地，涉及Wnt六肽Foxy‑5及其受保护的衍生物和肽片段的溶液相合成。

技术领域

本公开总体上涉及多肽合成领域，更具体地，涉及Wnt六肽Foxy-5的溶液相合成。本公开进一步涉及新颖三肽、四肽和五肽的溶液相合成。

背景技术

Foxy-5是一种甲酰化的、Wnt5a衍生的六肽和Wnt-5a模拟物，具有潜在的抗转移活性，目前正在作为候选药物研发以预防几种常见形式的癌症中的肿瘤扩散。

Foxy-5具有氨基酸序列For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH(SEQ_ID NO 1，图1)。静脉内施用后，Foxy-5结合并激活wnt-5a受体Frizzled-2和-5，Frizzled-2和-5激活wnt-5a介导的信号传导。增加的wnt-5a信号传导可能抑制内皮肿瘤细胞迁移和侵袭。

Foxy-5旨在补偿结肠癌患者中注意到的肿瘤组织中蛋白质Wnt-5a的缺乏，以降低转移的风险。最近一项对III期结直肠癌患者的回顾性研究的子分析显示，Wnt 5a低表达患者的比例明显高于对II期结直肠癌(CRC)患者的先前研究中所观察到的。CRC III期肿瘤患者与II期患者的不同之处主要在于，在与原发肿瘤相邻的淋巴结中存在肿瘤细胞，因此更具侵袭性且进展更快。在III期患者的近70％中观察到低水平的Wnt-5a，相比之下，肿瘤次晚期患者情况下的比例为约45％。这支持了Wnt-5a水平显著影响疾病进程的假设。

基于旨在记录候选药物的安全性概况的已完成的针对Foxy-5的1b期研究，针对2期的药代动力学和剂量确定，Foxy-5现在用于2期临床试验研究，其中结肠癌患者的治疗将在诊断时在进行手术之前开始。该治疗旨在持续最多12周，或直到开始化疗。

Foxy-5及其制备方法描述于国际专利号WO 06130082 A1。迄今为止，用于临床前和临床研究的活性药物成分(API)是通过经典固相肽合成(SPPS)生产的，其中Foxy-5是通过线性1+1+1+1+1+1路径生产的，见图2。

因此，使用Fmoc策略(Fmoc＝芴基甲基氧基羰基)将序列For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH组装在带有C末端氨基酸Leu的2-氯三苯甲基树脂上。合成在SPPS反应器中进行并且由以下组成：交替偶联、乙酰化和N-α-脱保护程序。偶联在作为溶剂的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)或DMF/DCM(二氯甲烷)中进行。如果需要的话，它由以下组成：在激活剂和碱的存在下，将N-α-保护的氨基酸衍生物与前面的氨基酸偶联。甲酸在没有激活剂的情况下作为活性酯偶联。

如果偶联不完全，则可以继续进行或重复该程序。为了避免形成作为副产物的缺失序列的形成，在偶联步骤之后进行系统性乙酰化步骤(加帽)，或者，如果在再偶联步骤之后进行再偶联，则使用DMF、乙酸酐和吡啶。

乙酰化之后是N-α-脱保护程序，该程序由以下组成：用DMF洗涤树脂，用在DMF中的哌啶裂解Fmoc-基团，并且随后用DMF洗涤。在不完全裂解的情况下，可以重复如上所述的N-α-脱保护程序。对于每个单个步骤，添加溶剂和/或试剂，并且搅拌反应混合物，然后过滤以将溶剂和/或试剂从树脂除去。

重复偶联、乙酰化和N-α-脱保护步骤，直到树脂带有完整的肽序列For-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-OH。在甲酸活性酯的最终偶联之后，不进行乙酰化。通过用DMF和IPA洗涤肽树脂并随后在减压下干燥来完成SPPS。

通过在合适的清除剂(例如水和EDT)存在下用TFA处理肽树脂来完成从树脂上裂解肽和伴随的侧链保护基团裂解。随后，通过二维制备型HPLC在反相柱上使用ACN梯度洗脱(甲酸和乙酸系统)纯化获得的粗制肽。

将具有足够纯度的合并的级分冻干。在不符合设定的纯度标准的情况下，则将冻干物通过HPLC分析，并任选地通过如上概述的二维制备型HPLC再纯化。