[发明专利]用于生产有机酸的微生物细胞系的分离

说明书

适合用于有机酸的工业规模生产的微生物细胞系以及制造和分离这种细胞系的方法。

优先权声明

本发明要求于2018年6月18日提交的美国专利申请号62/686,463的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开整体上涉及过量生产有机酸的微生物细胞系及其制造方法。

背景技术

有机酸是指具有酸性的含碳化合物。有机酸的实例包括乙酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、丙酸等。由于它们是可完全降解的，有机酸可以被用在可生物降解聚合物的生产中。它们也具有其他重要的工业应用，包括作为食品添加剂。

发明内容

本公开提供了适合用于有机酸的工业规模生产的微生物细胞系以及制造和分离这种细胞系的方法。

在一个方面，提供了制造和分离微生物细胞系的方法，其中与亲代微生物细胞系相比，所分离的微生物细胞系过量生产有机酸。所述方法使用了在增补有有机酸的pH受控的培养基中，优选在非固定培养中亲代菌株的连续传代，其中pH值被控制在高于所述有机酸的pKa值。在一些实施方式中，所述pH优选在约5.5和约7.5之间的范围内，更优选为中性或接近中性，在约6.0和约7.0之间，并且最优选为约7.0。在一些实施方式中，所述培养基是固化的。在一些实施方式中，所述培养基增补有足以抑制正常微生物细胞生长的量的有机酸，例如以降低倍增速率或生长速率，例如，将倍增速率或生长速率降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多。在一些实施方式中，在连续传代的连续迭代中以逐渐增加的量增补所述有机酸。在一些实施方式中，在连续传代的连续迭代中以相同的量增补所述有机酸。在一些实施方式中，所述有机酸是丙酸、乳酸、乙酸或丁酸。在一些实施方式中，所述有机酸是丙酸，例如，所述培养基增补有约1.0％-3.0％的丙酸，例如，约3.0％的丙酸。在一些实施方式中，所述亲代细胞系是野生型生物。在一些实施方式中，所述亲代细胞系是来源于单细胞微生物的微生物细胞系。

在另一方面，提供了过量生产有机酸的微生物细胞系，其中在增补有有机酸的pH受控的培养基中使用连续传代来制造和分离所述微生物细胞系，其中pH值被控制在高于所述有机酸的pKa值，优选在约5.5和约7.5之间的范围内，更优选为中性或接近中性，在约6.0和约7.0之间，并且最优选为约7.0。

在另一方面，提供了过量生产有机酸的微生物细胞系，其中所述微生物细胞系具有直接或间接地主要改变细胞包膜的结构、组成和/或功能的突变。优选地，所述微生物细胞系包含表3中鉴定的至少2种基因组突变或类似突变。更优选地，所述微生物细胞系包含表3中鉴定的所有基因组突变或同源突变。在一个实施方式中，所述微生物细胞系在表3中鉴定的至少2个基因中包含突变或与其类似的突变。在另一个实施方式中，所述微生物细胞系在表3中鉴定的所有基因或其同源物(例如，在本文所述的另一菌种中的同源基因)中包含突变。在另一个实施方式中，所述微生物细胞系在含O抗原连接酶结构域蛋白中包含突变。在另一个实施方式中，所述微生物细胞系在M18家族氨肽酶中包含突变。在另一个实施方式中，所述微生物细胞系在氨基酸通透酶中包含突变。在另一个实施方式中，所述微生物细胞系在腺嘌呤糖基化酶中包含突变。

所述微生物可以是任何生产有机酸的微生物。在一个实施方式中，所述微生物来自丙酸杆菌属(Propionibacterium)(Acidipropionibacterium)，并且更优选为产丙酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)菌种。在另一个实施方式中，所述微生物来自乳酸杆菌属(Lactobacillus)，并且更优选为嗜酸性乳酸杆菌(L.acidophilus)菌种。在另一个实施方式中，所述微生物来自醋杆菌属(Acetobacter)。在另一个实施方式中，所述微生物来自葡糖杆菌属(Gluconobacter)。在另一个实施方式中，所述微生物来自梭菌属(Clostridium)，并且更优选为丁酸梭菌(C.butyricum)菌种。在一些实施方式中，所述有机酸是丙酸。在一些实施方式中，所述有机酸是乳酸。在一些实施方式中，所述有机酸是乙酸。在一些实施方式中，所述有机酸是丁酸。