[发明专利]适合于从RNA进行核酸扩增的DNA聚合酶突变体

说明书

提供：具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体，所述DNA聚合酶突变体包含由12个特定氨基酸A1‑A12组成的序列，其中所述具有逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体的特征在于A3和/或A10氨基酸被不同于引入突变之前的氨基酸残基的碱性氨基酸残基取代；试剂盒和包含所述DNA聚合酶的组合物；用于生产所述DNA聚合酶的方法；以及用于修饰具有逆转录酶活性的现有DNA聚合酶的方法。

技术领域

本发明涉及适合于从RNA进行核酸扩增反应的DNA聚合酶突变体。此外，本发明涉及一种用于增强现有的DNA聚合酶对从RNA进行核酸扩增的活性的方法，以及一种用于产生适合于从RNA进行核酸扩增反应的DNA聚合酶突变体的方法。

背景技术

DNA聚合酶在世世代代的遗传信息准确传递中，即在基因组的复制和保留中起核心作用。DNA聚合酶在细胞内起负责DNA合成的酶的作用，并在存在金属活化剂(比如Mg²⁺)的情况下，按DNA模板或多核苷酸模板复制所需的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括体内DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在DNA合成过程期间，DNA模板被复制一次或多次以产生相同的复制物。相比之下，DNA复制可在体外，例如在聚合酶链反应中重复多次。

所谓的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)为一种用于通过扩增来检测或量化目标RNA的技术，并在许多应用中使用。为了通过PCR扩增目标RNA，首先需要将RNA模板逆转录为cDNA。典型的RT-PCR方法通过使用逆转录酶用于从RNA模板合成cDNA和使用耐热DNA聚合酶用于从合成的cDNA作为模板进行核酸扩增来进行。在这种情况下，需要选择适合于所使用的逆转录酶和耐热DNA聚合酶两者的反应溶液组成。在某些情况下，反应管的盖子可在逆转录反应和随后的核酸扩增反应之间打开，并且不能忽视交叉污染的风险。因此，已经开发了一种单步RT-PCR方法，用于在不打开反应容器的情况下连续进行逆转录反应和PCR。在该方法中，可使用具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。然而，由于逆转录反应和PCR使用相同的反应溶液组成进行，因此需要平衡逆转录反应和PCR。进一步地，已经报道了用于在相同反应溶液组成中进行逆转录反应和PCR时提高逆转录效率的技术(参见专利文献1-3)。

近年来，提出了各种等温核酸扩增反应方法并投入实际使用。等温核酸扩增方法也经常与使用RNA作为模板的逆转录反应组合使用，并且出现了与如上所述的RT-PCR方法相同的问题。换句话说，对于RT-等温核酸扩增方法，也需要在相同反应溶液组成中进行逆转录反应和等温核酸扩增和平衡逆转录反应和等温核酸扩增。

引文列表

专利文献

专利文献1：JP-B 3844975

专利文献2：WO2012/139748

专利文献3：WO2014/090836

发明概述

本发明要解决的问题

本发明的目的为提供一种基因工程改良方法用于产生具有逆转录酶活性的DNA聚合酶，其适合于在同一容器中进行逆转录反应和核酸扩增反应。

问题的解决方案

本发明人努力地研究开发了具有逆转录酶活性的适合于进行逆转录反应和核酸扩增反应的DNA聚合酶突变体。结果，本发明人出乎意料地成功找到一种通过将突变引入到氨基酸序列中的特定位置来产生具有优于常规技术的逆转录酶活性的DNA聚合酶突变体的方法。从而完成了本发明。

本发明的第一实施方案涉及具有逆转录酶活性并包含由12个氨基酸A1-A12组成的序列的DNA聚合酶的突变体：

A1为支链氨基酸残基，

A2为亲水性中性氨基酸残基或疏水性脂肪族氨基酸残基，

A3为亲水性中性氨基酸残基，

A4为酸性氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，

A5为支链氨基酸残基，

A6为疏水性脂肪族氨基酸残基或亲水性中性氨基酸残基，